多重PCR技術(shù)在HIV分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、目的：針對(duì)env和gag雙基因片段擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作中易出現(xiàn)標(biāo)記錯(cuò)誤的問題,利用多重PCR技術(shù),建立首輪同時(shí)擴(kuò)增env和gag基因片段的多重RT-PCR方案,并將此方法應(yīng)用于2008～2010年吉林省報(bào)告的HIV-1陽(yáng)性樣本亞型鑒定,比較2008～2009和2010年2個(gè)時(shí)段吉林省HIV-1不同亞型的流行特點(diǎn)及發(fā)展趨勢(shì)。
　　方法：選擇28份HIV陽(yáng)性樣本(CRF07_BC11份,B’亞型10份,CRF01_AE7份),根據(jù)已知病毒載量

2、將樣本血漿稀釋成6個(gè)載量濃度(2000copies/ml～50copies/ml),提取RNA模板進(jìn)行首輪env和gag基因片段的多重RT-PCR擴(kuò)增,陽(yáng)性率大于95％的最低載量濃度定義為敏感度。將樣本稀釋為1000 copies/ml,重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),計(jì)算kappa值以評(píng)價(jià)一致性。273份HIV陽(yáng)性樣本用于多重RT-PCR方法與巢式PCR方法的比較,計(jì)算兩者陽(yáng)性率差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和測(cè)序結(jié)果的一致性。用多重RT-PCR方法對(duì)189份

3、2008～2009年和2010年吉林省HIV新報(bào)告的樣本進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,確定樣本亞型。
　　結(jié)果：env和gag基因片段擴(kuò)增敏感度分別為1000copies/ml和2000copies/ml,一致性強(qiáng)度分別為高度(Substantial,K=0.627)和中等(Moderate,K=0.537)。多重RT-PCR方法(env為75.5％,gag為75.8％)與巢式PCR方法(env為73.3％, gag為73.

4、6％)的擴(kuò)增陽(yáng)性率無顯著性差異(P>0.05),測(cè)序結(jié)果也具有較好一致性(ICC=0.998,P<0.01)。2008～2009和2010年吉林省新報(bào)告樣本的亞型分析結(jié)果顯示,2008～2009年樣本中檢出共9種亞型,2010年樣中檢出共6種亞型,其中的主要亞型為CRF01_AE(2008～2009年占52.4％,2010年占63.4％)。
　　結(jié)論：首輪env和gag片段同時(shí)擴(kuò)增的多重RT-PCR方案,在檢出率和序列測(cè)定質(zhì)量相當(dāng)