血管平滑肌細胞增殖相關環(huán)狀RNA的篩查分析及其調控機制初探.pdf

1、目的：環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類無5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴結構、以共價鍵形成的環(huán)形內源非編碼RNA。與線性RNA相比，不受RNA外切酶、脫腺苷、脫帽的影響，表達更加穩(wěn)定。已有研究證明，circRNA存在于各種細胞當中，具有組織細胞和發(fā)育階段特異性，參與了細胞增殖、凋亡、衰老等生物學過程。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖和凋亡，

2、是動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病形成與發(fā)展的重要病理學事件。CircRNA是否參與VSMCs增殖調控，分子機制如何？迄今尚不清楚。本研究中我們采用基因芯片技術，篩查分析人主動脈平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cells， HASMCs）增殖相關circRNA和mRNA表達譜，從circRNA作為microRNA海綿、編碼蛋白質等角度進行生物信息學分析，為后續(xù)circRNA的分子機制探究提供線索；然后，對候

3、選circRNA進行敲降或過表達干預，探討其對HASMCs增殖、凋亡的影響。以期為VSMC增殖性疾病的發(fā)病機制研究提供新思路，為發(fā)掘新型治療靶點提供依據。
　　方法：
　　1.基因芯片分析circRNA和mRNA表達譜
　　采用基因芯片對PDGF誘導的增殖型和血清饑餓誘導的靜止型HASMCs中的circRNA和mRNA表達譜進行分析，差異基因的篩選標準為fold change≥2或≤-2，P<0.05。
　　2.

4、差異表達circRNA的qRT-PCR驗證
　　選取13種差異表達的circRNA，分別在環(huán)化位點兩側設計反向（divergent）引物，通過實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術，檢測它們在增殖型和靜止型HASMCs中的表達水平，通過2-ΔΔCt法計算差異倍數。
　　3.差異circRNA和mRNA的生物信息學分析

5、>　　對差異表達的mRNA和差異表達的circRNA宿主基因進行GO（Gene ontology）分析，GO包括分子功能、生物過程以及細胞組成等，同時進行pathway分析。
　　結合現有的AGO2沉淀的RNA測序數據[1]，篩選與AGO2結合，可能作為microRNA海綿的差異表達circRNA。選取其中5種circRNA，通過生物信息學軟件分別預測它們可能結合的microRNA，然后分析這些microRNA可能調控的差異mRN

6、A，構建circRNA-microRNA-mRNA互作網絡。
　　對差異表達的circRNA與其對應的線性mRNA的表達相關性進行分析。并通過circRNADb平臺，分析篩選可能編碼蛋白質的circRNA。
　　4.circRNA對HASMCs增殖、凋亡的影響
　　基于circRNA的環(huán)化位點設計合成特異的siRNA，轉染HASMCs，通過qRT-PCR驗證敲降效率，通過Western Blot檢測相關蛋白的表達水平，

7、通過流式細胞術檢測細胞周期、細胞磷脂酰絲氨酸外翻情況，分析細胞增殖、凋亡狀態(tài)。
　　5.circRNA表達載體構建
　　根據has_circ_0001304以及has_circ_0040705的序列設計引物，引物5'端引入EcoR I酶切位點，3'端引入Xba I酶切位點。提取RNA，經反轉錄后進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后對目的條帶進行膠回收，經EcoR I/Xba I雙酶切后回收片段，插入pcDNA3_1(+) Cir

8、cRNA Mini Vector真核基因表達載體中，轉化后挑取單菌落，進行菌落PCR和雙酶切鑒定，最后進行測序分析。
　　結果：
　　1.基因芯片結果顯示，與靜止型HASMCs相比，增殖型HASMCs中有66種circRNA表達水平出現上調，68種circRNA表達水平降低；有3019種mRNA表達上調，701種mRNA表達下調。
　　2.通過qRT-PCR技術，檢測13種circRNA在增殖型HASMCs和靜止型HA

9、SMCs的表達水平。結果顯示，12種circRNA的表達差異與基因芯片的結果一致。
　　3.GO分析顯示差異表達的circRNA相關的mRNA可以參與到蛋白運輸（protein transport）等細胞活動中；Pathway分析發(fā)現最有意義的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate activated protein kinase，AMPK）和microRNA兩個通路。
　　而對于差異表達的mRN

10、A，GO分析可知其參與到細胞周期阻滯負向調節(jié)（negative regulation of cell cycle arrest）等生物過程，而pathway分析可知涉及的通路包括促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等信息傳遞和增殖相關通路。
　　通過分析發(fā)現，78種差異circRNA能夠與AGO2結合，可能作為microRNA海綿發(fā)揮作用。選取其中的5種circRN

11、A： hsa_circ_0000069、hsa_circ_0002579、hsa_circ_0004872、hsa_circ_0006371、hsa_circ_0040705，構建circRNA-microRNA-mRNA互作網絡，結果顯示，它們與通過microRNA的介導C2orf44，IGF2BP1，HMGA2，KLF7等254種差異基因具有共表達相關性，為后續(xù)探究circRNA的調控靶點提供了重要線索。
　　對差異表達的ci

12、rcRNA與其對應的線性mRNA的表達相關性進行分析，發(fā)現circRNA與其對應的線性mRNA的表達沒有相關性。通過circRNADb平臺，篩選得到24種circRNA含有核糖體進入序列和開放閱讀框，提示它們可能編碼蛋白質。
　　4.采用siRNA敲降HASMCs中的has_circ_0040705和has_ circ_0001304，Western Blot分析表明，細胞增殖標志基因PCNA水平顯著降低， VSMC表型分化標志基

13、因SM22、凋亡相關蛋白Bax的水平顯著升高。流式細胞術分析表明，敲降has_circ_0040705或has_circ_0001304均能促進HASMCs凋亡。此外，敲降has_circ_0001304能夠明顯抑制QKI蛋白的表達。
　　5.經酶切鑒定、測序分析證明，成功構建 has_circ_0001304和has_circ_0040705的真核表達載體，為下一步功能與機制研究奠定了基礎。
　　結論：
　　1.在H