血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)環(huán)狀RNA的篩查分析及其調(diào)控機(jī)制初探.pdf

1、目的：環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類無5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)、以共價(jià)鍵形成的環(huán)形內(nèi)源非編碼RNA。與線性RNA相比，不受RNA外切酶、脫腺苷、脫帽的影響，表達(dá)更加穩(wěn)定。已有研究證明，circRNA存在于各種細(xì)胞當(dāng)中，具有組織細(xì)胞和發(fā)育階段特異性，參與了細(xì)胞增殖、凋亡、衰老等生物學(xué)過程。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖和凋亡，

2、是動(dòng)脈粥樣硬化等血管重塑性疾病形成與發(fā)展的重要病理學(xué)事件。CircRNA是否參與VSMCs增殖調(diào)控，分子機(jī)制如何？迄今尚不清楚。本研究中我們采用基因芯片技術(shù)，篩查分析人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human aortic smooth muscle cells， HASMCs）增殖相關(guān)circRNA和mRNA表達(dá)譜，從circRNA作為microRNA海綿、編碼蛋白質(zhì)等角度進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)circRNA的分子機(jī)制探究提供線索；然后，對(duì)候

3、選circRNA進(jìn)行敲降或過表達(dá)干預(yù)，探討其對(duì)HASMCs增殖、凋亡的影響。以期為VSMC增殖性疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新思路，為發(fā)掘新型治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.基因芯片分析circRNA和mRNA表達(dá)譜
　　采用基因芯片對(duì)PDGF誘導(dǎo)的增殖型和血清饑餓誘導(dǎo)的靜止型HASMCs中的circRNA和mRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為fold change≥2或≤-2，P<0.05。
　　2.

4、差異表達(dá)circRNA的qRT-PCR驗(yàn)證
　　選取13種差異表達(dá)的circRNA，分別在環(huán)化位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)反向（divergent）引物，通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)它們?cè)谠鲋承秃挽o止型HASMCs中的表達(dá)水平，通過2-ΔΔCt法計(jì)算差異倍數(shù)。
　　3.差異circRNA和mRNA的生物信息學(xué)分析

5、>　　對(duì)差異表達(dá)的mRNA和差異表達(dá)的circRNA宿主基因進(jìn)行GO（Gene ontology）分析，GO包括分子功能、生物過程以及細(xì)胞組成等，同時(shí)進(jìn)行pathway分析。
　　結(jié)合現(xiàn)有的AGO2沉淀的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)[1]，篩選與AGO2結(jié)合，可能作為microRNA海綿的差異表達(dá)circRNA。選取其中5種circRNA，通過生物信息學(xué)軟件分別預(yù)測(cè)它們可能結(jié)合的microRNA，然后分析這些microRNA可能調(diào)控的差異mRN

6、A，構(gòu)建circRNA-microRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)。
　　對(duì)差異表達(dá)的circRNA與其對(duì)應(yīng)的線性mRNA的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。并通過circRNADb平臺(tái)，分析篩選可能編碼蛋白質(zhì)的circRNA。
　　4.circRNA對(duì)HASMCs增殖、凋亡的影響
　　基于circRNA的環(huán)化位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異的siRNA，轉(zhuǎn)染HASMCs，通過qRT-PCR驗(yàn)證敲降效率，通過Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，

7、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻情況，分析細(xì)胞增殖、凋亡狀態(tài)。
　　5.circRNA表達(dá)載體構(gòu)建
　　根據(jù)has_circ_0001304以及has_circ_0040705的序列設(shè)計(jì)引物，引物5'端引入EcoR I酶切位點(diǎn)，3'端引入Xba I酶切位點(diǎn)。提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，經(jīng)EcoR I/Xba I雙酶切后回收片段，插入pcDNA3_1(+) Cir

8、cRNA Mini Vector真核基因表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序分析。
　　結(jié)果：
　　1.基因芯片結(jié)果顯示，與靜止型HASMCs相比，增殖型HASMCs中有66種circRNA表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，68種circRNA表達(dá)水平降低；有3019種mRNA表達(dá)上調(diào)，701種mRNA表達(dá)下調(diào)。
　　2.通過qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)13種circRNA在增殖型HASMCs和靜止型HA

9、SMCs的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，12種circRNA的表達(dá)差異與基因芯片的結(jié)果一致。
　　3.GO分析顯示差異表達(dá)的circRNA相關(guān)的mRNA可以參與到蛋白運(yùn)輸（protein transport）等細(xì)胞活動(dòng)中；Pathway分析發(fā)現(xiàn)最有意義的腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine Monophosphate activated protein kinase，AMPK）和microRNA兩個(gè)通路。
　　而對(duì)于差異表達(dá)的mRN

10、A，GO分析可知其參與到細(xì)胞周期阻滯負(fù)向調(diào)節(jié)（negative regulation of cell cycle arrest）等生物過程，而pathway分析可知涉及的通路包括促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）等信息傳遞和增殖相關(guān)通路。
　　通過分析發(fā)現(xiàn)，78種差異circRNA能夠與AGO2結(jié)合，可能作為microRNA海綿發(fā)揮作用。選取其中的5種circRN

11、A： hsa_circ_0000069、hsa_circ_0002579、hsa_circ_0004872、hsa_circ_0006371、hsa_circ_0040705，構(gòu)建circRNA-microRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，它們與通過microRNA的介導(dǎo)C2orf44，IGF2BP1，HMGA2，KLF7等254種差異基因具有共表達(dá)相關(guān)性，為后續(xù)探究circRNA的調(diào)控靶點(diǎn)提供了重要線索。
　　對(duì)差異表達(dá)的ci

12、rcRNA與其對(duì)應(yīng)的線性mRNA的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)circRNA與其對(duì)應(yīng)的線性mRNA的表達(dá)沒有相關(guān)性。通過circRNADb平臺(tái)，篩選得到24種circRNA含有核糖體進(jìn)入序列和開放閱讀框，提示它們可能編碼蛋白質(zhì)。
　　4.采用siRNA敲降HASMCs中的has_circ_0040705和has_ circ_0001304，Western Blot分析表明，細(xì)胞增殖標(biāo)志基因PCNA水平顯著降低， VSMC表型分化標(biāo)志基

13、因SM22、凋亡相關(guān)蛋白Bax的水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，敲降has_circ_0040705或has_circ_0001304均能促進(jìn)HASMCs凋亡。此外，敲降has_circ_0001304能夠明顯抑制QKI蛋白的表達(dá)。
　　5.經(jīng)酶切鑒定、測(cè)序分析證明，成功構(gòu)建 has_circ_0001304和has_circ_0040705的真核表達(dá)載體，為下一步功能與機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　1.在H