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文檔簡介
1、目的:
酒精性肝?。╝lcoholic liver disease, ALD)是指由于長期飲酒或短期內(nèi)大量飲酒引起的肝損傷。其病因明確,但發(fā)病機制復雜多樣,尚未被完全闡明。我們團隊前期通過酒精灌胃法建立大鼠ALD模型,發(fā)現(xiàn)酒精刺激后引起沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1, SIRT1)、精氨酸/絲氨酸剪接因子10(splicing factor, arginine/serine-rich10,SFRS10)的mRNA及蛋白表
2、達水平逐漸下降。SFRS10可以引起Lipin-1選擇性剪接,從而形成不同的異構體。隨后我們在細胞水平,給予AML-12小鼠肝細胞梯度酒精刺激培養(yǎng),建立酒精性肝細胞模型,并降低SIRT1表達,發(fā)現(xiàn)SIRT1低表達導致SFRS10表達水平下降,總Lipin-1及Lipin-1β表達水平升高,而Lipin-1α表達水平則顯著降低。本研究選用能代謝酒精的AML-12小鼠肝細胞,應用SFRS10siRNA降低AML-12小鼠肝細胞內(nèi)SFRS10
3、表達,應用油紅O染色法觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;在細胞水平闡釋降低SFRS10表達對SIRT1和Lipin-1表達水平的影響。
方法:
復蘇小鼠AML-12細胞給予含10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1‰HEPES、1%青-鏈霉素抗體的高糖DMEM培養(yǎng)基在5%CO2,37℃恒溫條件下培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期,降低SFRS10基因表達,分別設置空白對照組(Blank)、SFRS10siRNA陰性對照組(SFRS10siRNA NC)
4、、SFRS10siRNA組、SFRS10siRNA+酒精組。
陰性對照組及實驗組分別將SFRS10siRNA陰性無關對照序列、SFRS10siRNA轉(zhuǎn)染至AML-12細胞,空白對照組中加入等體積的脂質(zhì)體,培養(yǎng)4-6h后,更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至18-24小時, SFRS10siRNA+酒精組中加入120mM濃度的酒精,其余三組加入相同體積的生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細胞。分別應用RT-qPCR和Western blo
5、t法檢測SFRS10、SIRT1、Lipin-1、Lipin-1α、Lipin-1β的mRNA及蛋白表達水平;用4%多聚甲醛固定,給予行油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。
結果:
1降低小鼠AML-12細胞中SFRS10表達,通過RT-qPCR法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1α及Lipin-1βmRNA的表達水平,正常AML-12細胞SIRT1、SFRS10、細胞核內(nèi)Lipin-1α表
6、達水平相對較高,總Lipin-1及細胞質(zhì)內(nèi)Lipin-1β表達水平均較低;與空白對照組相比, SFRS10siRNA組SFRS10的表達顯著降低,SIRT1及總Lipin-1的表達水平無明顯變化(P均>0.05);細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平明顯升高,而細胞核中Lipin-1α表達水平明顯降低(P均<0.01);與SFRS10siRNA組比較,SFRS10siRNA+酒精組中,SFRS10、Lipin-1α表達水平進一步降低(P均<
7、0.01),SIRT1表達水平也出現(xiàn)明顯降低(P<0.01),Lipin-1β表達水平進一步上升,總Lipin-1表達水平也出現(xiàn)明顯升高(P均<0.01);與空白對照組相比 SFRS10siRNA NC組內(nèi)各指標表達水平無明顯差異(P均>0.05)。降低SFRS10基因表達后,與空白對照組相比,SFRS10siRNA NC組無明顯變化(P>0.05),SFRS10siRNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高(P<0.01);而且SFR
8、S10siRNA+酒精組,Lipin-1β/α的比值進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
2降低SFRS10表達后,通過Western blot法檢測SIRT1、SFRS10、總Lipin-1、Lipin-1β及Lipin-1α的蛋白表達水平,我們發(fā)現(xiàn)與RT-qPCR法檢測結果一致:正常AML-12細胞中SIRT1、SFRS10和Lipin-1α蛋白表達水平較高,而Lipin-1及Lipin-1β表達水平較低;與空白
9、對照組相比, SFRS10siRNA組中SFRS10的表達顯著降低,細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平明顯升高,細胞核中Lipin-1α表達水平明顯降低(P均<0.01),而SIRT1及總Lipin-1的表達水平無明顯變化(P>0.05);SFRS10siRNA+酒精組中, SFRS10、Lipin-1α表達水平進一步下降(P均<0.01);SIRT1表達水平也出現(xiàn)明顯降低(P<0.01);細胞質(zhì)中Lipin-1β表達水平進一步升高,總L
10、ipin-1表達水平也出現(xiàn)明顯升高(P均<0.01);與空白對照組相比, SFRS10siRNA陰性對照組中各個指標表達無明顯差異(P均>0.05)。降低SFRS10表達后,與空白對照組相比,SFRS10siRNA NC組無明顯變化(P>0.05), SFRS10siRNA組Lipin-1β/α的比值顯著升高(P<0.01);SFRS10siRNA+酒精組,Lipin-1β/α的比值進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
11、 3通過油紅O染色法觀察小鼠AML-12細胞,比較各組間脂質(zhì)變化情況,我們發(fā)現(xiàn):正常對照組及陰性對照組中AML-12細胞內(nèi)未見明顯脂肪變性;通過基因工程技術降低SFRS10表達后,SFRS10siRNA組中AML-12細胞內(nèi)可見較多的紅色脂滴;而 SFRS10siRNA+酒精組中AML-12細胞內(nèi)可見大量的紅色脂滴。
結論:
SFRS10表達降低對SIRT1無顯著影響,它可能作為上游因子通過調(diào)節(jié)Lipin-1的選擇
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