FAK對(duì)不同分化狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞定向遷移的調(diào)控研究.pdf

1、神經(jīng)干/祖細(xì)胞（Neural stem/progenitor cells，NSCs）的遷移對(duì)哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷修復(fù)至關(guān)重要。許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生是由于NSCs遷移缺陷導(dǎo)致的，所以激發(fā)內(nèi)源或外源移植的NSCs向神經(jīng)損傷部位的遷移，是治療神經(jīng)性疾病的關(guān)鍵因素。我們的前期研究已表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）誘導(dǎo)的NSCs趨化遷移與其分化狀態(tài)、粘著斑（foc

2、al adhesion, FA）動(dòng)態(tài)變化及肌動(dòng)蛋白（F-actin）細(xì)胞骨架重塑相關(guān)。粘著斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）作為胞質(zhì)酪氨酸激酶，在生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的信號(hào)通路及細(xì)胞遷移過程中起著關(guān)鍵作用，然而其在NSCs的趨化遷移過程中的作用還未被知詳。本實(shí)驗(yàn)研究將探討在不同分化狀態(tài)的NSCs趨向VEGF的遷移過程中，F(xiàn)AK對(duì)FA的動(dòng)態(tài)變化和分布的調(diào)控作用，及其與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號(hào)通路之間的

3、相互調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　利用C17.2 NSCs進(jìn)行趨化遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PF573228（FAK抑制劑，簡(jiǎn)稱PF-228）抑制FAK活性后，顯著抑制了VEGF誘導(dǎo)的不同分化狀態(tài)的細(xì)胞趨化遷移：Boyden chamber群體細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，未分化、分化1 d和分化3 d的NSCs的遷移數(shù)量均減少；Dunn chamber單細(xì)胞趨化遷移實(shí)驗(yàn)，未分化和分化1 d的NSCs向VEGF的趨化遷移明顯受抑，細(xì)胞的遷移速度降低，遷移持續(xù)性也下降。另外

4、，PF-228顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)球和大鼠SVZ神經(jīng)球的鋪展及遷移，神經(jīng)球的鋪展半徑減小，細(xì)胞遷移的速度也降低。
　　FA在細(xì)胞遷移過程中呈不斷形成-解聚的動(dòng)態(tài)周轉(zhuǎn)狀態(tài)，F(xiàn)AK可以通過影響FA的形成及動(dòng)態(tài)組裝從而調(diào)控細(xì)胞遷移。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在VEGF誘導(dǎo)下易伸出偽足，胞內(nèi)的微絲結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑。許多小斑點(diǎn)樣的FA在片狀偽足處形成，F(xiàn)A的總數(shù)量增加。而在PF-228作用下，F(xiàn)A總數(shù)量減少，新生FA比例下降，成熟

5、FA比例增加，說明不僅FA的形成受到抑制，而且成熟FA的解聚也受阻。并且在PF-228作用下，VEGF促進(jìn)的pY397-FAK和pY31/pY118-paxillin的磷酸化作用顯著下調(diào)。
　　細(xì)胞遷移至劃痕區(qū)域過程中，VEGF誘導(dǎo)的新生FA主要分布在鋪展的片狀偽足處，前后FA極性分布比例較大，而PF-228處理后，成熟穩(wěn)定的FA僅局限分布在細(xì)胞邊緣。相應(yīng)的，活細(xì)胞跟蹤觀察FA動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，VEGF顯著提高了FA的周轉(zhuǎn)速度，F(xiàn)A的

6、組裝加快，在細(xì)胞遷移前端不斷形成小斑點(diǎn)FA，細(xì)胞尾端的FA也快速解聚；而PF-228作用下，細(xì)胞周邊的FA斑點(diǎn)較大，周轉(zhuǎn)緩慢，細(xì)胞尾端的FA解聚也較慢。轉(zhuǎn)染FAK活性突變體發(fā)現(xiàn)，pRKGFP-FAK能夠響應(yīng)VEGF的刺激，F(xiàn)A數(shù)量變多，長(zhǎng)度變短，而FAK-Y397F失活型指示的FA顯著長(zhǎng)于pRKGFP-FAK指示的FA，并且不響應(yīng)VEGF的刺激，F(xiàn)A沒有變化。說明FAK的Y397位點(diǎn)的活化在FA動(dòng)態(tài)變化中起著關(guān)鍵作用。
　　PF-

7、228抑制FAK活性后，不同程度的抑制了PI3K/Akt和MAPKs信號(hào)通路的下游分子，包括Akt、ERK1/2、SAPK/JNK和p38MAPK的磷酸化作用，所以FAK影響細(xì)胞遷移及FA形成可能與PI3K和MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)：抑制PI3K/Akt或MAPKs信號(hào)通路，不同程度的阻礙了大鼠SVZ神經(jīng)球的遷移及VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，特別是ERK1/2和SAPK/JNK信號(hào)通路顯著長(zhǎng)效的抑制了神經(jīng)球的鋪展；不同分化狀態(tài)的FA形成也

8、受到不同程度的抑制；劃痕遷移過程中，細(xì)胞不具明顯的極性形態(tài)，細(xì)胞前后端FA的極性分布比例也降低；Western blot也發(fā)現(xiàn)，VEGF誘導(dǎo)的FAK和Y31/118-paxillin的磷酸化也減弱，說明在細(xì)胞遷移及FA動(dòng)態(tài)周轉(zhuǎn)過程中，F(xiàn)AK與PI3K/Akt和MAPKs通路之間可能是相互調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。
　　最后，我們檢測(cè)了調(diào)控F-actin細(xì)胞骨架的Rac1-GTPase在VEGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和FA形成中的作用。過表達(dá)Rac1

9、激活型突變體Rac1-Q61L和Rac1-G12V，細(xì)胞趨化遷移的效率顯著升高，片狀偽足的伸展具有方向持續(xù)性，并且FA的數(shù)量顯著增多。而轉(zhuǎn)染Rac1顯性陰性突變體Rac1-T17N，F(xiàn)A的數(shù)量較少，說明活化的Rac1促進(jìn)FA形成，失活的Rac1抑制FA形成。在VEGF刺激下，pIRES2-GFP對(duì)照細(xì)胞和Rac1野生型細(xì)胞中的FA增加，而Rac1-Q61L和Rac1-G12V的細(xì)胞中的FA數(shù)量沒有進(jìn)一步增多，Rac1-T17N的細(xì)胞也不

10、響應(yīng)VEGF的刺激，說明VEGF誘導(dǎo)的FA形成過程中需要Rac1的活化。另外，F(xiàn)AK抑制劑作用下，無論是Rac1野生型還是Rac1激活型細(xì)胞中的FA形成均受到抑制，說明Rac1參與調(diào)控FA的形成最終還是需要通過FAK的活化。
　　綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)研究，我們明確了FAK在不同分化狀態(tài)的細(xì)胞遷移中的作用，弄清了FAK對(duì)FA動(dòng)態(tài)周轉(zhuǎn)的調(diào)控機(jī)制，及其在此過程中與PI3K/Akt、MAPKs和Rac1信號(hào)通路相互作用的機(jī)制，為更好的調(diào)控