高氧環(huán)境中ROS對(duì)Caco-2細(xì)胞的作用及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的:長(zhǎng)期的高氧治療會(huì)對(duì)機(jī)體器官有嚴(yán)重的毒性作用?；钚匝?reactiveoxygen species，ROS)包括超氧自由基和過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)，過(guò)多生成的ROS對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)是有害的。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)是炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，作為一種促炎細(xì)胞因子能夠在高氧狀態(tài)下介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)炎癥反應(yīng)時(shí)，ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且增加的細(xì)胞因子會(huì)影響免

2、疫球蛋白A(ImmunoglobulinA，IgA)和分泌片（secretory component，SC）的表達(dá)，過(guò)量產(chǎn)生的ROS通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）作為MAPK家族的一個(gè)成員能夠被ROS、TNF-a激活，并且在由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用

3、。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor-1-α，HIF-1-α)在修復(fù)缺氧誘導(dǎo)基因和細(xì)胞氧環(huán)境中起著關(guān)鍵作用，與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制高度相關(guān)。
　　因此通過(guò)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化進(jìn)一步探討ROS在高氧誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，通過(guò)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路、ASK1和HIF-1-α的變化探討ROS參與高氧誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制。
　　研究方法:本研究利用不同濃度的過(guò)氧化氫和高氧體外

4、刺激腸上皮Caco-2細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放入37℃和5％ CO2孵箱中培養(yǎng)。每2到3天換一次培養(yǎng)基，處理前，將細(xì)胞(1×106 ml)傳代，第二天，細(xì)胞在不同濃度的H2O2(100，200和400μM)和85％氧（三氣培養(yǎng)箱，85％的氧氣和5％的二氧化碳）中孵育24小時(shí)，未加任何處理因素的作為對(duì)照組。24小時(shí)后收集細(xì)胞，

5、分別提取全蛋白質(zhì)、RNA和進(jìn)行其他不同的實(shí)驗(yàn)，即采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量;MTT檢測(cè)細(xì)胞生存能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平;免疫組化方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的表達(dá)情況;Western Blot方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC蛋白的表達(dá)水平;Real-time PCR方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、ASK、H

6、IF-1-α、TNF-α和SC mRNA的表達(dá)水平。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)6到8次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，采用Prism Graph6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpaired t-test)，結(jié)果以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、ROS檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組(21.45±9.34)有少量的ROS表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2中隨著H2O2濃度的增加ROS的

7、表達(dá)逐漸增加，而高氧組（139.19±34.79）ROS的表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);2、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組(1.25±0.25)相比，100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2組中細(xì)胞的存活率均明顯下降(P＜0.01)，高氧組(0.52±0.06)細(xì)胞存活率下降更明顯(P＜0.01);3、細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞被H2O2和高氧處理6小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2(9.70±3.

8、14)、200μM H2O2(10.73±2.29)、400μM H2O2(11.52±2.80)和85％高氧組(17.90±5.91)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(4.60±1.98);細(xì)胞被H2O2和高氧處理12小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組100μMH2O2、200μMH2O2、400μMH2O2和85％高氧組(15.95±3.56)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(5.33±2.62)，細(xì)胞凋亡率隨著ROS濃度的增加而升高，并且高氧組細(xì)胞凋亡率最高(P＜0

9、.01);但細(xì)胞被H2O2和高氧處理24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2和85％高氧中細(xì)胞凋亡率反而降低(P＜0.01)。不同濃度的H2O2及高氧處理6小時(shí)和12小時(shí)后，其細(xì)胞凋亡率明顯高于24小時(shí)(P＜0.01)。但死亡率卻相反，即H2O2和高氧處理6小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為:100μMH2O2（1.20±0.37）、200μM H2O2（9.52±2.03）、400μM H2O2（15.26±

10、2.39）及高氧（19.64±1.80）;處理12小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為:100μMH2O2（8.67±0.14）、200μM H2O2（12.95±1.99）、400μM H2O2（17.76±1.50）及高氧（23.31±1.66）;處理24小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為100μM H2O2(6.23±3.83)、200μM H2O2(14.74±1.24)、400μM H2O2(19.90±4.57)及高氧（37.35±6.55），6小時(shí)細(xì)胞

11、死亡率明顯低于12小時(shí)和24小時(shí)(P＜0.01);4、RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的免疫組化染色結(jié)果顯示對(duì)照組RelA和RelB位于細(xì)胞漿，呈淡黃色，在H2O2組和高氧組RelA和RelB位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核，呈棕褐色。RelA與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μ

12、M H2O2處理的Caco-2細(xì)胞，RelA的表達(dá)較低(P＜0.01)。RelB與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細(xì)胞，RelB的表達(dá)較低(P＜0.01)。對(duì)照組TNF-α染色呈淺黃色，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈黃或棕褐色。100μM H2O2、200μM H2O2、4

13、00μM H2O2和高氧組處理后的Caco-2細(xì)胞TNF-α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細(xì)胞，TNF-α的表達(dá)較低(P＜0.01)。HIF-1-α主要集中于細(xì)胞漿，在對(duì)照組有少量的表達(dá)呈淺黃色，在H2O2組和高氧組HIF-1-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，染色呈黃或棕褐色。與對(duì)照組相比，HIF-1-α在100μM H2O2、200μMH2O2

14、、400μM H2O2和高氧組中表達(dá)升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μMH2O2、200μMH2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細(xì)胞，HIF-1-α的表達(dá)較低(P＜0.01)。SC主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，與對(duì)照組相比，SC在200μM H2O2和400μM H2O2和高氧組中表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細(xì)胞，SC的表達(dá)

15、較低(P＜0.01)。5、Western Blot結(jié)果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細(xì)胞中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的蛋白表達(dá)水平顯著上升，高氧組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、 TNF-α和SC的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC(P＜0.01)。6、Real-time PCR結(jié)果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細(xì)胞

16、中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的mRNA表達(dá)水平顯著上升，高氧組RelA(1.77±0.27)、RelB(2.23±0.53)、ASK1(1.81±0.35)、HIF-1-α(1.90±0.40)、TNF-α(2.14±1.04)和SC(2.10±0.67)的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組RelA(0.71±0.22)、RelB(0.58±0.15)、ASK1(0.80±0.19)、HIF-1-α(0