散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤lncRNA表達(dá)譜及HOTAIR作用機(jī)制研究.pdf

1、胸主動(dòng)脈瘤是一種由于多種原因?qū)е轮鲃?dòng)脈壁結(jié)構(gòu)破壞、強(qiáng)度減弱，發(fā)生瘤樣擴(kuò)張或者膨出的高危性疾病。大多數(shù)胸主動(dòng)脈瘤患者無(wú)明顯癥狀，但是可進(jìn)行性擴(kuò)大并發(fā)生致命性的并發(fā)癥，如瘤體破裂或主動(dòng)脈夾層，預(yù)后兇險(xiǎn)。影像技術(shù)的普及提高了胸主動(dòng)脈瘤的早期診斷率，為避免并發(fā)癥的發(fā)生并延緩手術(shù)提供了藥物治療的時(shí)間。但是目前臨床并沒(méi)有有效藥物抑制胸主動(dòng)脈瘤的擴(kuò)大。而對(duì)于胸主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的研究與理解是能否找到特異性治療方法的關(guān)鍵。雖然綜合征型和家族型胸主動(dòng)脈瘤已

2、經(jīng)發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病基因位點(diǎn)，但是占大多數(shù)的散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤(STAA)的遺傳背景和發(fā)病機(jī)制仍不明確。新近發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可以在多個(gè)水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，也被報(bào)道與多種心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)。但是lncRNA在胸主動(dòng)脈瘤領(lǐng)域的作用仍不清楚。本課題旨在通過(guò)研究胸主動(dòng)脈瘤中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜差異，以及差異表達(dá)lncRNA(HOTAIR)對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞功能和細(xì)胞外基質(zhì)重塑的影響，來(lái)探索lncRNA在胸主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。<

3、br>　　研究?jī)?nèi)容包括以下兩部分：
　　第一部分 散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜研究
　　目的:研究散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤lncRNA表達(dá)譜差異，并找到可能與致病相關(guān)的目標(biāo)lncRNA。
　　方法:選取2013年7月到2015年6月在阜外醫(yī)院行手術(shù)的胸主動(dòng)脈瘤患者升主動(dòng)脈瘤體組織樣本（STAA組）和行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)患者主動(dòng)脈打孔組織樣本（對(duì)照組），經(jīng)年齡、性別等指標(biāo)配對(duì)后，共4對(duì)樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA+mRNA聯(lián)合芯片分

4、析。差異基因中挑選四條lncRNA(uc031qjh.1、ENST0000045164、HOTAIR、LIT3501)和2條mRNA（CTSB和TNFSF10），進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證芯片結(jié)果。對(duì)差異表達(dá)基因行Gene Ontology Enrichment分析、lncRNA-mRNA共表達(dá)分析和lncRNA靶基因預(yù)測(cè)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，STAA組中1105條(5％)lncRNA出現(xiàn)明顯

5、差異表達(dá)，其中151條(1％)表達(dá)上調(diào)，954條(4％)表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)的mRNA有1568條(5％)，其中1175條(4％)上調(diào)，393條(1％)下調(diào)。qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，STAA組uc031qjh.1、ENST0000045164、LIT3501、CTSB和TNFSF10的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，HOTIAR的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。富集最多差異表達(dá)基因的生物過(guò)程是血管新生、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)、

6、白細(xì)胞遷移和細(xì)胞粘附。通過(guò)結(jié)合Gene Ontology分析和lncRNA-mRNA共表達(dá)分析，得到細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，由277個(gè)lncRNA和50個(gè)mRNA組成，其中包括HOTAIR。
　　結(jié)論:散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜與正常對(duì)照相比存在明顯差異。生物信息學(xué)分析顯示lncRNA HOTAIR可能與胸主動(dòng)脈瘤相關(guān)。
　　第二部分 lncRNA HOTAIR對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)

7、的影響
　　目的:擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證HOTAIR在胸主動(dòng)脈瘤中的差異表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索其對(duì)平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的影響。
　　方法:病例組選取2013年7月到2015年6月在阜外醫(yī)院行手術(shù)的胸主動(dòng)脈瘤患者升主動(dòng)脈瘤體組織樣本24例，對(duì)照組選取冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)患者主動(dòng)脈打孔組織樣本22例，心臟移植供體升主動(dòng)脈樣本2例。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證HOTAIR在兩組間表達(dá)差異。體外培養(yǎng)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)，通過(guò)siRNA技術(shù)

8、沉默HOTAIR，觀察HASMC凋亡、增殖、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的改變，并通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)觀察mRNA表達(dá)譜差異及發(fā)生改變的信號(hào)通路。
　　結(jié)果:胸主動(dòng)脈瘤中HOTAIR表達(dá)量降低，且與瘤體直徑呈負(fù)相關(guān)。沉默HOTAIR可以促進(jìn)HASMC凋亡，抑制增殖。HASMC中沉默HOTAIR可以上調(diào)MMP-2的表達(dá)，下調(diào)Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。RNA測(cè)序結(jié)果顯示沉默HOTAIR后差異表達(dá)基因共620條，其中

9、上調(diào)53條，下調(diào)567條。差異基因功能富集分析顯示改變最顯著的是平滑肌細(xì)胞收縮功能，共相關(guān)基因13條，均表達(dá)下調(diào)，包括ACTA2、CALD1、MYLK等。信號(hào)通路富集分析顯示MAPK、Wnt、TGF-beta等信號(hào)通路發(fā)生改變。
　　結(jié)論:散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達(dá)量明顯降低。沉默HOTAIR可以通過(guò)損傷平滑肌細(xì)胞收縮功能和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，進(jìn)而可能引起胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。
　　散發(fā)型胸主動(dòng)脈瘤中l(wèi)nc