TIP47在NAFLD和HCV感染導(dǎo)致的肝細胞脂肪變性中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪肝（fattyliverdisease，F(xiàn)LD）是一種可逆性病變，主要表現(xiàn)為肝細胞脂肪變性。脂肪肝在各國的發(fā)病率為10％～24％。隨著我國國民經(jīng)濟水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)、生活方式及生活習(xí)慣發(fā)生明顯改變，脂肪肝的發(fā)病率不斷增加。導(dǎo)致脂肪肝的兩個最常見因素為非酒精性因素和HCV（hepatitisCvirus，HCV）感染，非酒精性因素導(dǎo)致的脂肪肝稱為NAFLD（non-alcoholicfattyliverdi

2、sease，NAFLD）。NAFLD和HCV感染所導(dǎo)致的脂肪肝均表現(xiàn)為肝細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集及脂滴（lipiddroplet，LD）形成。
　　LDs的基本結(jié)構(gòu)是中性脂質(zhì)核心，表面單層磷脂層和鑲嵌在磷脂層的脂滴蛋白。目前，關(guān)于脂滴如何形成的機理尚不清楚，最流行的假說是脂質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并在雙層膜內(nèi)聚集，隨著體積的增大，膜結(jié)構(gòu)向胞漿面膨出形成球狀結(jié)構(gòu)，并最終從膜結(jié)構(gòu)脫離形成獨立的LDs。
　　LDs以往常被認(rèn)為是單純儲存中性脂質(zhì)的細胞

3、內(nèi)結(jié)構(gòu)。近年來，LDs越來越受到重視，認(rèn)為其是一個動態(tài)的細胞器，在許多細胞途徑中發(fā)揮作用，包括與微管相作用進行主動轉(zhuǎn)運。細胞內(nèi)微管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運是由kinesin和dynein家族的分子動力蛋白驅(qū)動的。kinesin介導(dǎo)正向轉(zhuǎn)運，dynein介導(dǎo)負(fù)向轉(zhuǎn)運，他們可以選擇性地與微管結(jié)合從而控制細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的運動。
　　在LDs生成過程中，一些蛋白發(fā)揮了重要作用，其中脂滴表面PAT家族蛋白可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。在哺乳動物，PAT家族包含5個成員：

4、perilipin、ADRP、TIP47、S3-12和OXPAT。PAT家族成員在分子大小、組織表達、與LDs的親和力、穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面各不相同。但他們都具有高度同源的N末端PAT結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)代謝及LDs形成中發(fā)揮作用。
　　1999年，TIP47被首先發(fā)現(xiàn)可以與6-磷酸甘露糖受體（mannoserecepter6-phosphoricacid，MPR）結(jié)合介導(dǎo)其從內(nèi)體到高爾基網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)運。2001年，Wolins等發(fā)

5、現(xiàn)TIP47與脂滴蛋白ADRP及perilipin高度相似，與初期LDs形成相關(guān)，應(yīng)歸為脂滴相關(guān)蛋白。但TIP47在LDs生成及代謝中的具體作用及分子機制并不清楚。深入研究TIP47在LDs生物學(xué)中的作用及機制將為脂肪肝等脂肪變性疾病的的防治提供分子理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　本研究旨在確定TIP47蛋白在NAFLD和HCV感染導(dǎo)致的肝細胞脂肪變性中的作用；通過抑制TIP47蛋白在肝細胞中的表達確定TIP47蛋白對脂滴生

6、成及脂質(zhì)分布的影響；闡明細胞骨架在TIP47發(fā)揮生理功能中的作用，為脂滴生成模型提供分子基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1.制備兔抗小鼠TIP47多克隆抗體，確定TIP47在NAFLD動物模型ob/ob小鼠各種組織（尤其是肝臟）中的表達情況。
　　2.構(gòu)建穩(wěn)定表達HCV核心抗原的肝癌細胞系，分析microRNA表達譜并預(yù)測其靶基因，分析脂滴相關(guān)蛋白PAT家族在HCV核心抗原導(dǎo)致的肝細胞脂肪變性中的作用。
　　3.通過

7、siRNA技術(shù)抑制肝細胞系A(chǔ)ML12中TIP47的表達，觀察細胞內(nèi)脂滴形態(tài)變化及脂質(zhì)分布情況，確定TIP47的細胞生物學(xué)功能；并進一步探討微管蛋白在TIP47發(fā)揮生理功能中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功制備兔抗小鼠TIP47多克隆抗體，并確定TIP47與NAFLD發(fā)生相關(guān)。
　　運用分子生物學(xué)技術(shù)克隆表達了TIP47蛋白C末端398個氨基酸組成的可溶性蛋白，免疫新西蘭兔，成功制備兔抗小鼠TIP47多克隆抗體。在

8、NAFLD的動物模型ob/ob小鼠中，我們發(fā)現(xiàn)肝臟、骨骼肌、心肌和棕色脂肪組織等脂肪代謝活躍的組織TIP47表達明顯高于野生型小鼠。提示TIP47在包括肝臟在內(nèi)的組織細胞脂滴生成中發(fā)揮作用。
　　2.HCV核心抗原3a和1b可以通過調(diào)節(jié)microRNA及其靶蛋白誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性，并且PAT家族蛋白TIP47在HCV誘導(dǎo)的脂肪變性中發(fā)揮作用。
　　我們通過microRNA芯片及定量PCR技術(shù)確定了HCV核心抗原3a和1b的m

9、icroRNA表達譜及二者差異表達microRNA，通過分析預(yù)測差異表達microRNA的靶基因及其功能和所屬通路，確定了HCV核心抗原3a和1b可以誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性，同時發(fā)現(xiàn)一些脂肪代謝和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白（ACSL1、ACSL4、ACSL6、ABCA1、ABCC1、FABP2等）在這其中可能發(fā)揮作用。通過分析HCV核心抗原3a和1b對肝細胞脂滴表面蛋白PAT家族成員在肝細胞中表達的影響，明確了TIP47在HCV誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性過程

10、中表達升高，可能與HCV誘導(dǎo)的肝細胞脂滴生成相關(guān)。
　　3.TIP47可以與微管相作用介導(dǎo)肝細胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreticulum，ER）到脂滴的轉(zhuǎn)運。
　　抑制小鼠AML12肝細胞系TIP47的表達使細胞內(nèi)脂滴變小變少，儲存在脂滴內(nèi)的TG減少，在肝細胞內(nèi)TG總量未發(fā)生明顯變化的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張并且TG儲集增多。在油酸誘導(dǎo)肝細胞脂滴形成過程中，TIP47從ER逐漸

11、聚集到脂滴表面。綜上所述，TIP47可以介導(dǎo)TG從ER到脂滴的轉(zhuǎn)運。隨后，通過間接免疫熒光實驗，我們發(fā)現(xiàn)TIP47蛋白在有或無油酸刺激脂滴形成時，均與微管蛋白α-tubulin存在共定位，因此，TIP47介導(dǎo)TG從ER到脂滴的轉(zhuǎn)運可能與微管相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　本研究中，我們成功制備敏感特異的兔抗小鼠TIP47多克隆抗體。利用該抗體發(fā)現(xiàn)TIP47在NAFLD及HCV核心抗原誘導(dǎo)的肝脂肪變中顯著升高。首次通過microRNA