Rab32通過ATGL調(diào)控脂質(zhì)水解影響肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他肝損傷因素所導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積的一類疾病。目前對于非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制研究還不是很清楚?！岸未驌簟睂W(xué)說是目前對非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制一種廣泛認(rèn)可的學(xué)說，即首先由于胰島素抵抗等因素導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)異常蓄積，其次肝細(xì)胞內(nèi)異常蓄積的脂質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞進(jìn)一步的損害，非酒精性脂肪性肝炎，肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生。因此，研究非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病過程中的分子機(jī)制對于預(yù)防NAFLD疾

2、病譜的進(jìn)展有著重要意義。
　　Rab蛋白屬于小GTP結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族。Rab蛋白在細(xì)胞胞內(nèi)參與各種膜運(yùn)輸過程。Rab蛋白家族通過特有的分子開關(guān)機(jī)制，參與囊泡形成，轉(zhuǎn)運(yùn)，黏附，錨著，融合等過程，實現(xiàn)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。由于細(xì)胞胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)異常蓄積過程中會有大量的膜活動，因此不難推斷，Rab蛋白可能參與了細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的過程并在其中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報道Rab蛋白參與了多種細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積的

3、過程。Rab32作為Rab蛋白中目前唯一與線粒體共定位的Rab蛋白，極有可能參與了胞內(nèi)的能量代謝過程，目前已有文獻(xiàn)報道Rab32在饑餓狀態(tài)下參與了果蠅中外周脂肪體脂質(zhì)蓄積的過程，并且能夠改變其脂質(zhì)蓄積的程度。但是，目前對于Rab32在正常狀態(tài)和能量過剩狀態(tài)下影響細(xì)胞胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積程度及其可能的分子機(jī)制還未有報道。并且，Rab32蛋白在果蠅以及人類中的氨基酸序列有著顯著的種屬差異，其在不同種屬中的功能有可能完全不同。因此，研究Rab32蛋

4、白在肝細(xì)胞中對脂質(zhì)蓄積的影響及其可能機(jī)制有助于我們了解非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病分子機(jī)制，具有重要的意義。
　　目的:
　　研究Rab32蛋白對肝細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響及其可能的作用機(jī)制
　　方法:
　　1.利用eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)鑒定分析Rab32蛋白的相互作用蛋白在學(xué)校中心實驗室萬瑛主任的幫助下，我們利用profinity eXact蛋白純化標(biāo)簽，建立Rab32蛋白的eXact-6xHis蛋白串聯(lián)

5、親和純化系統(tǒng)，并且在真核系統(tǒng)里面驗證了eXact-6xHis純化系統(tǒng)的純化效率。我們使用eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)構(gòu)建了Hepa1-6plentisEHEGFPRab32細(xì)胞系，對細(xì)胞中Rab32蛋白進(jìn)行純化后，利用SDS-PAGE蛋白凝膠電泳對純化樣品進(jìn)行分離，并使用硝酸銀染色法驗證了純化效果。結(jié)果顯示，eXact-6xHis對Rab32蛋白的純化效果明顯，達(dá)到了送測質(zhì)譜的要求。因此，我們將蛋白純化樣本送測質(zhì)譜，利用非標(biāo)定量的

6、方法進(jìn)行檢測，鑒定分析出了Rab32蛋白可能的相互作用蛋白。
　　2.Rab32蛋白在肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用機(jī)制研究
　　在鑒定分析完Rab32蛋白的相互作用蛋白后，我們推斷出Rab32蛋白極有可能參與了胞內(nèi)的能量代謝過程。我們使用GEO數(shù)據(jù)庫對13例膽囊手術(shù)伴有非酒精性脂肪性肝病的病人以及13例膽囊手術(shù)不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人肝組織中Rab32mRNA水平進(jìn)行統(tǒng)計，并且我們自己收集6例膽囊手術(shù)伴有非酒精性脂肪性肝病的

7、病人以及6例膽囊手術(shù)不伴有非酒精性脂肪性肝病的病人的肝組織，QPCR顯示的結(jié)果與GEO數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果一致。隨后，我們以O(shè)A∶PA=2∶1模擬脂肪酸誘導(dǎo)HepG2和L02細(xì)胞，建立了非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型。收集細(xì)胞后，我們提取細(xì)胞總蛋白檢測Rab32蛋白在臘質(zhì)蓄積情況下的表達(dá)變化，所得結(jié)果與前面結(jié)果一致。這說明Rab32蛋白在脂質(zhì)蓄積過程中表達(dá)發(fā)生了變化，也提示我們Rab32蛋白在肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中發(fā)揮了作用。
　　隨后，我們對R

8、ab32蛋白進(jìn)行了過表達(dá)和干擾，檢測了Rab32蛋白在肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用，并且證明了Rab32蛋白主要通過影響肝細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)水解的過程進(jìn)而影響胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的程度。接著我們使用免疫共沉淀法檢測了Rab32蛋白是否和脂質(zhì)水解的關(guān)鍵酶ATGL存在著相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示Rab32是通過間接作用影響ATGL的表達(dá)改變，這符合我們質(zhì)譜結(jié)果中沒有檢測到ATGL蛋白的結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1).通過eXact-6xHis蛋白純化系統(tǒng)

9、對Rab32蛋白進(jìn)行純化，并使用非標(biāo)定量，5次對蛋白樣品進(jìn)針，Decoy評分篩選高可信度差異蛋白，分析出Rab32蛋白可能的相互作用蛋白有Rab38，PHB1以及PHB2。從功能和定位上說明，Rab32極有可能參與了胞內(nèi)的能量代謝過程。
　　2).GEO數(shù)據(jù)庫，臨床樣本QPCR顯示，非酒精性脂肪性肝病病人肝組織中Rab32mRNA表達(dá)水平低于正常對照組。使用HepG2以及L02細(xì)胞構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型后，Western

10、Blots結(jié)果顯示蛋白水平上Rab32蛋白在脂肪酸刺激組中蛋白表達(dá)水平同樣下降。過表達(dá)以及干擾Rab32蛋白表達(dá)后，在四個脂肪酸濃度梯度檢測胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平顯示，敲低Rab32蛋白能夠引起胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平下降。同時，通過對脂質(zhì)水解關(guān)鍵酶ATGL和脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶FASN的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，我們證實Rab32主要通過影響ATGL的表達(dá)水平進(jìn)而影響胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積水平的。隨后，免疫共沉淀實驗顯示Rab32是通過間接作用影響ATGL蛋白的表達(dá)改變