孔雀綠—磷鉬雜多酸法測(cè)定磷酸二酯酶活性及其抑制劑的影響.pdf

1、磷酸二酯酶（phosphodiesterases PDEs）是降解環(huán)腺苷一磷酸（cyclic adenosine monophosphate cAMP）和環(huán)鳥苷一磷酸（cyclic guanosine monophosphate cGMP）的酶的大家族，目前已有十一個(gè)PDEs被認(rèn)識(shí)。它們?cè)谏矬w中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的水平，影響生物體的多種生理功能。PDE4，7，8是特異性降解環(huán)腺苷一磷酸的酶，而PDE5，6，9是特異性降解環(huán)鳥苷一磷酸的

2、酶，PDE1，2，3，10和11是非特異性酶。PDEs抑制劑抑制PDEs的活性、影響生物體的生理功能。當(dāng)前，已有幾種PDEs抑制劑作為疾病的治療藥物在市場(chǎng)上銷售。另外有一些PDEs抑制劑的藥理作用和用藥安全性評(píng)估正在進(jìn)行。目前已知的測(cè)定生物體來(lái)源的PDEs活性和抑制劑對(duì)PDEs活性影響的方法均采用了3H或14C同位素，不但費(fèi)用較高，而且有一定的放射性污染，限制了其的應(yīng)用。 PDEs和堿性磷酸酶聯(lián)合降解環(huán)核苷一磷酸，釋放出的無(wú)機(jī)

3、磷酸，進(jìn)一步用孔雀綠（MG）-磷鉬雜多酸顯色法測(cè)定來(lái)測(cè)定釋放無(wú)機(jī)磷酸的量，以確定PDEs的活性和其抑制劑的影響。但該法在顯色階段受PDEs抑制劑的影響較大，需要改進(jìn)，減小抑制劑的影響。本課題進(jìn)行了這方面的嘗試，建立了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定了從兔腦中提取的PDEs的活性及研究了罌粟堿，對(duì)測(cè)定其活性的影響，結(jié)果表明：修飾后該方法簡(jiǎn)單可行，費(fèi)用低廉，而且對(duì)環(huán)境沒(méi)有放射性污染。拓寬了孔雀綠-磷鉬雜多酸顯色法在測(cè)定PDEs活性及其抑制劑對(duì)PDEs活

4、性的影響方面的應(yīng)用。 第一部分：孔雀綠-磷鉬雜多酸顯色法的條件建立。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，測(cè)定波長(zhǎng)為630nm，吸光值控制在1.35以下時(shí)，在1.6-11.3μmol/L磷濃度范圍，吸光度和磷濃度呈線性關(guān)系。緩沖液，甘油，磷酸二酯酶抑制劑（茶堿，鹽酸罌粟堿，西地那非）對(duì)顯色反應(yīng)的影響的研究結(jié)果表明：甘油對(duì)顯色反應(yīng)無(wú)影響。緩沖液對(duì)顯色反應(yīng)的影響小于5％。磷酸二酯酶抑制劑濃度小于50μmol/L時(shí)，對(duì)孔雀綠--磷鉬雜多酸顯色反應(yīng)的影響可以控