計(jì)算機(jī)輔助篩選磷酸二酯酶選擇性抑制劑的研究.pdf

1、目的：環(huán)磷酸腺苷酸(cyclic adenosine-3'，5'-monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷酸(cyclic guanosme-3'，5'-monophosphate，cGMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其在體內(nèi)水平的高低直接影響著多種重要的生理功能。如高血壓、心絞痛、充血性心衰、勃起功能障礙、哮喘、視覺障礙等，均與細(xì)胞內(nèi)cAMP或cGMP水平下降有關(guān)。為提高細(xì)胞內(nèi)cAMP和cGMP的水平，可通過激活腺苷酸環(huán)化酶(

2、adenylyl cyclases，Ac)和鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclases，GC)或抑制磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterases，PDEs)兩種途徑來實(shí)現(xiàn)。多年來的研究證明，PDEs及其同工酶在調(diào)節(jié)cAMP和cGMP細(xì)胞內(nèi)水平中扮演著重要的角色。由于PDEs同工酶為一個(gè)大家族，其結(jié)構(gòu)、體內(nèi)分布、生化特性及生理功能不盡相同，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的PDEs有11種之多，而且在人體內(nèi)分

3、布廣泛，生理作用涉及多個(gè)研究領(lǐng)域。 PDE酶作為多種疾病的治療靶點(diǎn)，其生化過程已很明確，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也比較清楚，研究進(jìn)展較快。目前已報(bào)道的PDEs抑制劑大多為PDE3，PDE4，PDE5三類結(jié)構(gòu)，截至2005年為止，已有3個(gè)PDE5抑制劑和4個(gè)PDE3抑制劑投入臨床使用，20多個(gè)PDE4抑制劑已進(jìn)入了臨床研究，另有兩個(gè)PDE4抑制劑待審批，而正處于研究開發(fā)階段的化合物仍有上百個(gè)。因此，PDEs作為新的治療靶點(diǎn)，其抑制劑的

4、研究已成為前景樂觀的新藥領(lǐng)域，引起了眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。 本研究通過計(jì)算機(jī)輔助篩選的方法研究磷酸二酯酶(PDEs)同功酶及其選擇性抑制劑的選擇特異性，來尋找PDEs專屬性藥物，進(jìn)一步以此指導(dǎo)合成出特定結(jié)構(gòu)的化合物或?qū)ΜF(xiàn)有化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，為得到特異性高，療效強(qiáng)，副作用低，同時(shí)具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特征的新藥提供理論依據(jù)。 方法： 首先對(duì)PDEs的一級(jí)序列及晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源性研究，然后從晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，通過配體和受

5、體的對(duì)接計(jì)算及分子動(dòng)力學(xué)研究，分析了PDEs抑制劑與PDEs的選擇性。從理論上提出了PDEs抑制劑的底物選擇性。本研究的主要內(nèi)容摘要如下： 1．PDEs的氨基酸序列比對(duì) 對(duì)已經(jīng)報(bào)道的833個(gè)PDE的序列進(jìn)行了比對(duì)，采用Vector9.0軟件包的AlignX模塊進(jìn)行序列比對(duì)。此后對(duì)已有晶體結(jié)構(gòu)的60個(gè)PDEs一級(jí)序列進(jìn)行了同源性比對(duì)。 2．FDEs晶體結(jié)構(gòu)的分析 我們?cè)谘芯克幬餀C(jī)理和設(shè)計(jì)藥物時(shí)通常都以已知結(jié)

6、構(gòu)為基礎(chǔ)進(jìn)行。所以，本課題又分析了已知立體結(jié)構(gòu)的PDE酶序列相似性，利用SPDV軟件，對(duì)60個(gè)已知晶體結(jié)構(gòu)的PDEs進(jìn)行類別內(nèi)及類別間的相似性研究。 3．模擬對(duì)接 依照上兩項(xiàng)研究的結(jié)果，從60個(gè)已知晶體結(jié)構(gòu)的PDE中選取15個(gè)有代表性的，并且?guī)в械孜锏拿缸鳛槭荏w，與目前已報(bào)道的32個(gè)化合物進(jìn)行對(duì)接計(jì)算。采用實(shí)驗(yàn)上常用的陽性對(duì)照方法來判斷。為了消除配體分子本身對(duì)結(jié)果的影響，我們?cè)谡綄?duì)接前還考察了分子量對(duì)結(jié)果的影響。對(duì)接計(jì)

7、算軟件采用Syby17.0軟件包的FlexX/Runmuti-ligand模塊和Amber99力場(chǎng)，取復(fù)合物中原配體周圍8A范圍為活性位點(diǎn)(active-site)進(jìn)行分子對(duì)接，采用經(jīng)驗(yàn)結(jié)合自由能函數(shù)作為打分函數(shù)來評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果。 結(jié)果： 1．PDEs的氨基酸序列比對(duì) 根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)分成14類，包括目前報(bào)道的11個(gè)家族和3個(gè)亞家族。對(duì)比對(duì)的序列對(duì)應(yīng)位置上的殘基進(jìn)行了宏觀性質(zhì)指標(biāo)(包括：極性、柔性、構(gòu)象參數(shù)等)分析，結(jié)

8、果表明各種來源的PDE酶結(jié)構(gòu)上有較大的相似性。 對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的60個(gè)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相似性研究，結(jié)果表明其具有較高的相似度，立體結(jié)構(gòu)框架基本一致。通過在833個(gè)PDE所分成的14類結(jié)構(gòu)中分別選擇一些序列與晶體結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在晶體結(jié)構(gòu)中都可以找到與它們近似的序列，表明晶體結(jié)構(gòu)具有廣泛的代表性。因此基于現(xiàn)有晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行的藥物選擇性研究顯得更有意義。 2．PDEs晶體結(jié)構(gòu)的分析 已知結(jié)構(gòu)的PDE坐標(biāo)疊合結(jié)果表明，

9、同一家族的PDE晶體結(jié)構(gòu)其空間骨架比較接近，不同家族的PDE由于序列上存在不同程度的差異，導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)的空間骨架略有差異，但大部分序列的骨架還是比較接近，各結(jié)構(gòu)中對(duì)應(yīng)部分的二級(jí)結(jié)構(gòu)都處在較相近的位置。說明不同來源的PDE在空間結(jié)構(gòu)上具有較高的保守性。 3．模擬對(duì)接 分子量小的化合物很容易進(jìn)入活性口袋區(qū)，從而得到穩(wěn)定構(gòu)象。所以在對(duì)接時(shí)盡量選取分子量相差不大的化合物進(jìn)行對(duì)接計(jì)算及分析。用對(duì)接結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)PDE抑制劑

10、與PDEs的結(jié)合有一定的特異性。 結(jié)論： 通過上述對(duì)PDE抑制劑的理論研究，得到了PDEs具有較高的選擇性的結(jié)果，即PDE抑制劑可選擇性地占據(jù)相應(yīng)PDEs家族酶的活性位點(diǎn)，從而抑制底物cAMP或cGMP的水解。此結(jié)果與實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果基本吻合，更進(jìn)一步證明了計(jì)算機(jī)輔助篩選方法的可靠性。為今后開發(fā)特異性高，療效強(qiáng)，副作用低的PDEs抑制劑提供了良好的理論研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為新型PDE抑制劑的研究與開發(fā)提供了一個(gè)可縮短了新藥研發(fā)