血管生成素1修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脂多糖誘導(dǎo)大鼠心肺損傷的研究.pdf

1、本研究以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)作為載體，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使其攜帶并高表達(dá)血管生成素1（Ang1）基因，增強(qiáng)UC-MSCs的作用。應(yīng)用UC-MSCs-Ang1植入大鼠急性肺損傷（ALI）模型后，觀察UC-MSCs與UC-MSCs-Ang1對(duì)ALI大鼠的抗炎修復(fù)作用、減輕肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)干細(xì)胞在肺組織的存活，提高ALI大鼠的存活率;研究UC-MSCs-Ang1抑制LPS誘導(dǎo)的心肌損傷炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌損傷

2、后心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響，為膿毒血癥急性心肺損傷的細(xì)胞及基因治療提供新的理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.人UC-MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定;構(gòu)建攜帶GFP和Ang1基因的慢病毒載體后轉(zhuǎn)染UC-MSCs，并檢測(cè)Ang1在轉(zhuǎn)染UC-MSCs中的表達(dá)情況。
　　2.建立UC-MSCs-Ang1治療LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI實(shí)驗(yàn)方法;觀察Ang1基因轉(zhuǎn)染后促進(jìn)UC-MSCs對(duì)LPS所致肺損傷、肺水腫、全身炎癥反應(yīng)、細(xì)胞植入率、生存率等

3、的改善作用。
　　3.觀察UC-MSCs-Ang1抑制LPS誘導(dǎo)的心肌損傷炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡;研究UC-MSCs-Ang1對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌損傷后心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響，為其在心血管疾病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及Ang1基因修飾UC-MSCs的獲得
　　1.UC-MSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增
　　2.UC-MSCs的形態(tài)及免疫表型檢測(cè)
　　3.UC-MS

4、Cs誘導(dǎo)分化能力的鑒定
　　4.Ang1基因的獲取與克隆
　　5.含有Ang1基因的慢病毒包裝、收獲及轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定
　　6.攜帶GFP和Ang1基因的慢病毒感染UC-MSCs后，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá);轉(zhuǎn)染72小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)MSCs中GFP表達(dá)、Western-Blot檢測(cè)MSCs中Ang1蛋白表達(dá)。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　二、血管生成素1修飾人臍帶間

5、充質(zhì)干細(xì)胞減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷
　　1.LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型的建立與分組
　　2.分別于造模后6h、24h、48h、8d、15d每組處死3-5只大鼠，收集血清、肺組織，進(jìn)行常規(guī)病理切片、支氣管肺泡灌洗液等標(biāo)本。
　　3.檢測(cè)肺組織濕干重比、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺組織髓過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)、HE染色觀察肺組織的病理改變及肺損傷嚴(yán)重程度病理評(píng)分。
　　4.ELISA法檢測(cè)血清中TNF-

6、α、TGF-β1、IL-6、IL-10的蛋白含量。
　　5.MSCs-Ang1在損傷肺組織的遷徙和植入的檢測(cè)
　　6.生存分析
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　三、血管生成素1修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠左室心肌重塑與功能
　　1.心電圖
　　2.超聲心動(dòng)圖
　　3.Millar導(dǎo)管檢測(cè)心功能參數(shù)
　　4.血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
　　5.病理學(xué)檢測(cè)心肌
　　6.實(shí)時(shí)定量RT-PC

7、R基因水平檢測(cè)
　　7.Western Blot檢測(cè)
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　結(jié)果：
　　一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及Ang1基因修飾UC-MSCs的獲得
　　1.培養(yǎng)、鑒定MSCs
　　2.誘導(dǎo)分化及鑒定
　　3.慢病毒表達(dá)載體的收獲及轉(zhuǎn)染效率
　　4.收獲Ang1基因修飾的UC-MSCs
　　二、Ang1修飾人UC-MSCs減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷
　　1.A

8、LI后肺組織病理學(xué)變化及肺損傷評(píng)分
　　腹腔注射LPS6h后，肺組織病理HE染色表現(xiàn)為明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，中性粒細(xì)胞明顯增多、滲出，并于48h達(dá)到高峰，同時(shí)出現(xiàn)一些小的膿腫及肺大皰。
　　2.支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)量及肺組織MPO活性
　　于24h和48h MSCs-Ang1組與MSCs組相比，支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，在第8d、15d MSCs-Ang1組的中性粒細(xì)胞數(shù)接近正常對(duì)照組。

9、>　　3.肺組織濕干重比
　　LPS組肺組織濕干重比升高(P＜0.05)，在ALI造模48h、8d，MSCs-Ang1組與MSCs相比肺組織濕干比明顯降低(P＜0.01-0.05)。
　　4.ELLISA檢測(cè)細(xì)胞因子
　　促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、TGF-β1的血清濃度的升高，證實(shí)了LPS造成了顯著的急性全身性炎癥反應(yīng)。
　　5.MSCs-Ang1在損傷肺組織的遷徙和植入的檢測(cè)
　　熒光顯微鏡觀察移植后

10、第8d，GFP+細(xì)胞在MSCs-Ang1組肺組織切片中陽(yáng)性率大于MSCs組。
　　6.生存分析
　　MSCs-Ang1治療組15d生存率明顯高于單純MSCs組，分別為70％和50％(P＜0.05)。
　　三、Ang1修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠左室心肌重塑
　　1.心電圖
　　LPS組部分心電圖異常表現(xiàn)，可見(jiàn)QRS波形電交替、心動(dòng)過(guò)速、心動(dòng)過(guò)緩等各種復(fù)雜心律失常;MSCs與MSCs-Ang1干

11、預(yù)后，未見(jiàn)明顯復(fù)雜心律失常減少，提示MSCs-Ang1可部分改善心電活動(dòng)。
　　2.超聲心動(dòng)圖
　　左心結(jié)構(gòu)的改變左心腔室大小;
　　左心收縮功能改變。
　　3.Millar導(dǎo)管測(cè)左心功能
　　提示MSCs-Ang1干預(yù)后對(duì)左室收縮功能顯著改善。
　　4.血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
　　心肌損傷明顯好轉(zhuǎn)。
　　提示雖然心肌損傷好轉(zhuǎn)，但是心臟功能減低持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，且心功能不易短期較快恢復(fù)。
　　5

12、.LPS誘導(dǎo)大鼠左室重塑心肌炎癥、細(xì)胞凋亡及MSCs-Ang1移植的影響
　　5.1 LPS誘導(dǎo)后大鼠心肌炎癥反應(yīng)及MSCs-Ang1移植的影響
　　HE染色:與LPS組比較，MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后的兩組，病理情況有所改善。
　　MSCs-Ang1移植影響LPS誘導(dǎo)大鼠心肌炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)檢測(cè)TNF-α、IL-6的表達(dá):對(duì)照組，心肌細(xì)胞內(nèi)少量、稀疏淺棕顆粒;LPS組

13、胞漿見(jiàn)較多深棕顆粒，MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后的兩組與LPS組相比，見(jiàn)棕色顆粒分布呈現(xiàn)散在且稀、疏，減少。
　　Western-Blot檢測(cè)TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá):LPS組TNF-α、IL-6表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。經(jīng)MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后，與LPS組比較，可見(jiàn)心肌組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)呈不同程度的下降（P＜0.05）。
　　5.2 LPS誘導(dǎo)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡及MSCs-Ang

14、1移植的影響
　　電鏡觀察凋亡細(xì)胞:與LPS組相比，各種病變均有所減輕，MSCs-Ang1干預(yù)較MSCs更明顯改善。
　　TUNEL染色觀察:LPS組左室凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率顯著增加(P＜0.01)。MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后與LPS組相比，細(xì)胞凋亡率明顯減少(P＜0.01)。
　　MSCs-Ang1移植抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)RIP3、Caspase-3表達(dá)
　　(1)凋亡相關(guān)RIP3表達(dá)
　　免疫組化染色

15、:LPS組RIP3棕黃色陽(yáng)性顆粒表達(dá)增加，且分布在細(xì)胞核周圍較多，MSCs與MSCs-Ang1兩組與LPS組比較，細(xì)胞內(nèi)棕黃色陽(yáng)性顆粒表達(dá)減少，且MSCs-Ang1注射后，棕黃色顆粒明顯減少。
　　Western-Blot檢測(cè)RIP3蛋白表達(dá):LPS組表達(dá)顯著增高(P＜0.01);但MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后，與LPS組比較，RIP3蛋白表達(dá)不同水平降低(P＜0.01-0.05)。
　　(2)凋亡相關(guān)Caspase-

16、3表達(dá)
　　Western-Blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白比值表達(dá):LPS組與對(duì)照組比較，比值顯著增高(P＜0.01);但MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后，與LPS組比較，比值不同水平降低(P＜0.01-0.05)。
　　6.GFP mRNA表達(dá)外源性MSCs-Ang1細(xì)胞在心肌組織植入情況檢測(cè)
　　提示Ang1能促進(jìn)MSCs在損傷后的心肌組織存活與植入。
　　結(jié)論：

17、r>　　1.人臍帶中可分離培養(yǎng)大量穩(wěn)定增殖的MSCs，其細(xì)胞表型穩(wěn)定，存在向成骨、脂肪細(xì)胞等多向分化能力，利用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，首次將攜帶GFP報(bào)告基因和Ang1基因的慢病毒載體高效的轉(zhuǎn)染人臍帶MSCs。
　　2.轉(zhuǎn)染于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的Ang1基因可通過(guò)減少中性粒細(xì)胞肺部浸潤(rùn)及MPO活性減輕肺水腫等明顯改善LPS誘發(fā)的肺損傷、減輕LPS引起的全身炎癥反應(yīng);提高了干細(xì)胞向炎性損傷肺組織的遷徙和植入。
　　3.LPS可導(dǎo)致大鼠心肌