常山酮調(diào)控Th17細(xì)胞介導(dǎo)的CXCL1表達(dá)對乳腺癌抑制作用的研究.pdf

1、目的：研究乳腺癌發(fā)病過程中，Th17細(xì)胞與趨化因子CXCL1相關(guān)性；CXCL1的生物學(xué)作用及其機(jī)制；常山酮對乳腺癌的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：臨床實(shí)驗(yàn)：收集臨床46例乳腺癌患者癌組織、癌旁非癌組織（3?5cm)和遠(yuǎn)端正常組織（>5cm)樣本及血液樣本，20例健康志愿者血液樣本。用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th17細(xì)胞頻率；ELISA法檢測血清IL-17，CXCL1濃度；免疫組織化學(xué)方法檢測 IL-17、CXCL1、CXCR2，下游指

2、標(biāo)蛋白 EGFR、Bcl-2、CyclinDl、MMP-9、VEGF以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)指標(biāo)磷酸化AKT、NF-kB在乳腺組織樣本中的表達(dá)；RT-PCR法檢測乳腺組織樣本中IL-17AmRNA、RORytmRNA及CXCL1 mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：人源性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CXCL1分泌水平，細(xì)胞用重組人IL-17處理后，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液

3、中CXCL1分泌水平；兩種細(xì)胞各分為三個(gè)組：空白對照組、重組人CXCL1處理組和anti-CXCR2中和抗體組，CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞增殖能力；流式凋亡細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡水平；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell迀移實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞迀移能力；ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化AKT、NF-kB蛋白濃度。動物實(shí)驗(yàn)：建立小鼠乳腺癌模型并給予常山酮處理。80只6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分為四組：健康對照組（G1組）、常山酮低劑

4、量組（G2組）、常山酮高劑量組（G3組）和腫瘤對照組（G4組）；四周后處死小鼠，留取新鮮腫瘤組織及外周血樣本。測量腫瘤體積和質(zhì)量。流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th17細(xì)胞頻率；免疫組化法檢測腫瘤組織中IL-17、CXCL1、Bcl-2和VEGF的表達(dá)；RT-PCR法檢測腫瘤組織中IL-17A mRNA，RORyt mRNA及CXCL1 mRNA表達(dá)水平；ELISA法檢測血清IL-17和CXCL1的濃度。
　　結(jié)果：臨床實(shí)驗(yàn)：與健康志愿者相

5、比，乳腺癌患者處周血Th17細(xì)胞頻率增加(P=0.001)，血清 IL-17、CXCL1濃度明顯升高（P=0.005，P=0.011);與遠(yuǎn)端正常組織相比，IL-17、CXCL1、CXCR2，下游指標(biāo)蛋白 EGFR、Bcl-2,CyclinDl、MMP-9，VEGF以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)指標(biāo)磷酸化AKT、NF-kB在乳腺癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)（均為P<0.05)，IL-17AmRNA、RORyt mRNA及 CXCL1 mRNA表達(dá)增加(均為P

6、<0.05)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CXCL1分泌隨時(shí)間增加而增加，重組人IL-17處理組CXCL1分泌增加（均為P<0.01);與空白對照組相比，重組人CXCL1處理組細(xì)胞增殖和迀移能力增強(qiáng)、凋亡率降低，而anti-CXCR2中和抗體組細(xì)胞增殖和迀移能力減弱、凋亡率升高（均為P<0.05)；細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，細(xì)胞內(nèi)磷酸化AKT、NF-kB蛋白濃度在重組人CXCL1處理組明顯升高，在anti-CXCR2中和抗

7、體組明顯降低（均為P<0.05)。動物實(shí)驗(yàn)：小鼠乳腺癌模型成功建立，腫瘤對照組的腫瘤體積和質(zhì)量均明顯大于常山酮低劑量和高劑量組（均為P<0.05);與健康對照組相比，腫瘤對照組外周血Th17細(xì)胞頻率明顯升高，而與腫瘤對照組相比，常山酮低劑量和高劑量組外周血Th17細(xì)胞頻率均明顯降低（均為P<0.05)；在常山酮低劑量和高劑量組中，IL-17、CXCL1、Bcl-2和 VEGF在腫瘤組織的蛋白表達(dá)均弱于腫瘤對照組（均為P<0.05)；與腫

8、瘤對照組相比，腫瘤組織中IL-17AmRNA、RORyt mRNA及CXCL1 mRNA在常山酮低劑量組無明顯差異，而在常山酮高劑量組中明顯降低（均為P<0.05)；與健康對照組相比，血清IL-17和CXCL1濃度在腫瘤對照組明顯升高，而與腫瘤對照組相比，常山酮低劑量組和高劑量組均顯著降低（均為P<0.05)。
　　結(jié)論：乳腺癌及癌旁組織中Th17細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-17和趨化因子CXCL1高表達(dá)，且IL-17能夠上調(diào)CXCL1