多西環(huán)素對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞(SKOV3)及其干細(xì)胞樣細(xì)胞(SKOV3-CSC)的體外影響.pdf

1、目的：探討多西環(huán)素（Doxycycline，DC）對(duì)人卵巢癌細(xì)胞（SKOV3）及其干細(xì)胞樣細(xì)胞（SKOV3/CSC）的體外影響，并初步探索其抑瘤機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)親本細(xì)胞 SKOV3（人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞）及其順鉑耐藥細(xì)胞SKOV3/CDDP并連續(xù)傳代，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。采用無(wú)血清培養(yǎng)法培養(yǎng)SKOV3/CSC細(xì)胞，并以流式細(xì)胞儀檢SKOV3及SKOV3/CSC細(xì)胞CD133表達(dá)率，用Alde

2、fluor法檢測(cè)ALDH酶活性。用MTS法檢測(cè)不同濃度（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）多西環(huán)素對(duì)SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC細(xì)胞的抑制率，及低濃度（5μg/ml）多西環(huán)素對(duì)SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞順鉑敏感性的影響。
　　2.以流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）多西環(huán)素處理后的S

3、KOV3及SKOV3/CSC細(xì)胞的凋亡率，以及各組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的變化。并用電子顯微鏡觀察20μg/ml多西環(huán)素處理后的SKOV3、SKOV3/CSC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　3.以 Western-Blotting檢測(cè)不同濃度（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）多西環(huán)素處理后 SKOV3/CSC細(xì)胞中 Caspase-3、Caspase-9以及胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的表達(dá)情況。
　　4.

4、以 Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度多西環(huán)素處理后的SKOV3（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）及SKOV3/CSC（0μg/ml、5μg/ml）細(xì)胞的遷移及侵襲能力變化。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示SKOV3、第一、三、五、七、九代SKOV3/CSC細(xì)胞的 CD133表達(dá)率分別為（0.99±0.02）％、（1.11±0.06）%、（1.34±0.05）%（1.26±0.14）%、（1.

5、32±0.07）%、（1.93±0.14）%隨著傳代次數(shù)增加 CD133表達(dá)率無(wú)明顯增高， ALDH陽(yáng)性率分別為（0.35±0.01）%、（0.79±0.02）%、（33.30±0.16）%（67.65±0.44）%、（90.24±0.16）%、（91.66±0.64）%，隨著傳代次數(shù)增加ALDH陽(yáng)性率顯著增高。
　　2.MTS結(jié)果顯示多西環(huán)素可抑制SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC細(xì)胞體外增殖，并可增加SKOV

6、3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞的順鉑敏感性。
　　2.1.多西環(huán)素抑制 SKOV3細(xì)胞體外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3細(xì)胞抑制率分別為（-4.39±2.99）%、（-4.32±3.35）%、（11.76±1.73）%、（36.24±2.01）%（ P=0.232>0.05、P=0.279>0.05、P=0.001<0.05、P<0.0001），作用48h后抑

7、制率分別為（-3.71±2.20）%、（0.94±0.92）%、（3.18±1.20）%、（47.74±2.35）%（P=0.1487>0.05、P=0.4499>0.05、P<0.0001、P<0.0001），具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性。
　　2.2.多西環(huán)素抑制 SKOV3/CDDP細(xì)胞體外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3/CDDP細(xì)胞抑制率分別為（2.38±1.65）

8、%、（11.63±1.23）%、（36.74±1.38）%、（50.54±0.85）%。（P=0.3219>0.05、P=0.0004>0.05、P<0.0001、P<0.0001），48h抑制率分別為（5.57±0.30）%、（18.75±0.25）%、（40.63±0.73）%、（56.77±0.49）%（P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001），具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性。
　　2.3.多西環(huán)素抑制

9、SKOV3/CSC細(xì)胞體外增殖。5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后 SKOV3/CSC細(xì)胞的抑制率分別為（2.75±0.52）%、（17.28±2.30）%、（26.02±1.70）%、（53.88±2.12）%（P=0.0914>0.05、P=0.0002<0.05、P<0.0001、P<0.0001），48h抑制率分別為（9.68±2.95）%、（23.84±2.87）%、（49.20±

10、2.98）%、（70.58±1.22）%（P=0.0373<0.05、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001），具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性。
　　2.4.SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞比SKOV3細(xì)胞對(duì)多西環(huán)素更加敏感，多西環(huán)素對(duì) SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞的 IC50分別為（36.05±0.05）μg/ml、（36.85±0.13）μg/ml，與 SKOV3細(xì)胞的 IC50（50.32±0

11、.52）μg/ml相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001、P<0.0001）。2.5多西環(huán)素可增加 SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞順鉑敏感性。經(jīng)5μg/ml鹽酸多西環(huán)素處理后 SKOV3/CDDP的 IC50值由（16.81±0.20）μg/ml下降至（11.12±0.09）μg/ml（P<0.0001），SKOV3/CSC的 IC50值由（17.40±0.03）μg/ml下降至（9.36±0.10）μg/ml（P<0.

12、0001）。
　　3.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示多西環(huán)素可誘導(dǎo) SKOV3、SKOV3/CSC細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位降低。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。
　　3.1.以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3細(xì)胞凋亡率分別為（3.89±0.07）%、（3.95±0.06）%、（4.03±0.07）%、（5.53±0.06）%，20μg/ml和40μg/ml組與對(duì)照

13、組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.1266>0.05、P=0.0546>0.05、P<0.027、P<0.0001）
　　3.2.以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3/CSC細(xì)胞凋亡率分別為（3.45±0.14）%、（8.14±0.21）%、（10.27±0.18）%、（19.55±0.32）%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.7724>0.05、P<0.0001、P<0

14、.0001、P<0.0001）。
　　3.3.以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降分別為（3.81±6.45）%、（21.53±3.72）%、（50.54±4.72）%、（71.67±8.73)%，與對(duì)照組相比除5μg/ml組外差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.6611>0.05、P=0.0242<0.05、P<0.0001、P<0.0001）。
　　3.4

15、.SKOV3/CSC細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降分別為(15.24±2.83)%、(36.86±3.46)%、(49.57±3.89)%、(96.58±3.42)%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0085<0.05、P=0.0006<0.05、P=0.0003<0.05、P<0.0001）。3.5透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)20μg/ml多西環(huán)素作用24h后SKOV3細(xì)胞線(xiàn)粒體輕度腫脹，嵴斷裂，部分膜融合，模糊不清。SKOV3/CSC細(xì)胞線(xiàn)

16、粒體中至重度腫脹，線(xiàn)粒體空泡化，部分線(xiàn)粒體髓樣化。其他細(xì)胞器無(wú)明顯改變。
　　4.Western-Blotting結(jié)果顯示以5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml多西環(huán)素作用SKOV3/CSC細(xì)胞24h后胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量分別為0.40±0.00、0.52±0.01、0.74±0.001、0.84±0.00與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P=0.0025<0.05、P=0.0002<0.05、P<0.

17、0001、P<0.0001），Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.00、0.54±0.01、0.73±0.01、0.99±0.00，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001、P<0.0001）， Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量分別為0.55±0.00、0.69±0.01、0.75±0.00、0.94±0.00與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.0001、P<0.0001、

18、P<0.0001、P<0.0001）。三者均呈劑量依賴(lài)性。
　　5.Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以5μg/ml、10μg/ml多西環(huán)素作用24h后 SKOV3遷移能力下降(46.08±4.82)%、(74.41±1.30)%（ P<0.0001、P<0.0001）,侵襲能力下降(4.31±2.36)%、（40.57±2.79）%（P=0.5103>0.05、P=0.0002<0.05）。以5μg/ml多西環(huán)素作用24h

19、后SKOV3/CSC遷移能力下降(29.74±1.74)%（P=0.001<0.05）,侵襲能力下降(34.67±3.16)%（P<0.0001）。
　　結(jié)論：
　　1.多西環(huán)素對(duì)SKOV3、SKOV3/CDDP及SKOV3/CSC細(xì)胞具有增殖抑制作用，且多西環(huán)素可增加SKOV3/CDDP、SKOV3/CSC細(xì)胞順鉑敏感性。
　　2.多西環(huán)素可誘導(dǎo)SKOV3/CSC發(fā)生線(xiàn)粒體途徑的凋亡。
　　3.多西環(huán)素除了對(duì)

20、SKOV3、SKOV3/CSC細(xì)胞具有直接抑制作用之外，還可以降低SKOV3、SKOV3/CSC細(xì)胞的遷移、侵襲能力。
　　4.無(wú)血清培養(yǎng)法可富集ALDH+細(xì)胞，可作為SKOV3/CSC細(xì)胞富集培養(yǎng)的一種方法。
　　5.CD133不適用于鑒別無(wú)血清培養(yǎng)法富集的SKOV3干細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　6.線(xiàn)粒體可能成為根除卵巢癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，多西環(huán)素作為一種線(xiàn)粒體蛋白合成抑制劑，可能成為除傳統(tǒng)化療藥物外的一種新型抗腫瘤藥物，為我們