MG5的表達,鑒定以及在胃癌中的功能機制研究.pdf

1、背景：我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，腫瘤標志物，尤其是癌前預警分子和早診分子是提高胃癌生存率的重要診斷工具，但是目前尚缺乏這樣的分子標志物。我實驗室前期制備并初步篩選了MG5-Ab,MG7-Ab等一系列胃癌相關的單抗，顯示出很好的臨床應用前景。但還缺乏較大規(guī)模的回顧性研究以及抗原鑒定等基礎性研究。
　　目的：研究MG5在預警，早診和預后方面的臨床價值；鑒定MG5的抗原本質；探究MG5在胃癌中的生物學功能以及相關分子機制。
　　方法：I

2、HC法檢測MG5在大規(guī)模癌前病變(N=509；467)以及腫瘤組織中(n=747)的表達，統(tǒng)計學分析MG5表達與癌前進展、胃癌發(fā)生、預后的相關性；WB、IP、MS、IF、慢病毒感染等方法鑒定MG5抗體特異性識別的抗原；MTT，F(xiàn)ACS、慢病毒感染、WB、IF、Co-IP、MS、裸鼠皮下成瘤、溶酶體結合攝取等實驗研究MG5的腫瘤生物學功能以及相關分子機制。
　　結果：
　　一、MG5在大規(guī)模胃粘膜癌前病變人群中的預警作用

3、>　　我們將陰性表達組的疾病進展或癌變風險設為1，相比而言，1.MG5強陽性（++）和極強陽性（+++）的胃黏膜病變的癌前進展風險分別是3.35和5.21。2.MG5陽性（+）和強陽性（++）的癌前病變進展為胃癌的風險分別為2.51和4.12。3.MG5陽性（+/++）時，IM/DYS病變的癌發(fā)生的風險顯著提高（MG5+：2.71，MG5++：6.01）。4.MG5和H.pylori雙陽性或MG5單獨強陽性時，癌前病變組織進展為胃癌的風

4、險均顯著增加(MG5+, HP+:2.80；MG5++,HP+:3.48；MG5++:14.68)。以上陽性結果P值均<0.05。
　　二、MG5的表達及臨床病理學意義
　　相對于癌旁組織，MG5在人類常見的八種腫瘤中表達均顯著升高（P<0.05），包括食管鱗癌，胃腺癌，結腸腺癌，直腸腺癌，肺鱗癌，肺腺癌,乳腺導管癌，胰腺導管癌。MG5的表達在女性胃腺癌組織中顯著高于男性（P=0.028），還發(fā)現(xiàn)它在分化較差的乳腺導管癌中表

5、達高于分化較好的癌（P=0.003）。MG5的表達與女性胃癌患者和伴隨淋巴結轉移的肺癌患者的預后呈負相關，多因素回歸分析證實它是判斷這兩種患者預后的獨立指標(P=0.015,P=0.030)。
　　三、MG5的抗原鑒定—LAM P2A
　　我們采用胃癌細胞系SGC7901開展MG5的抗原鑒定工作，WB實驗顯示MG5分子量大約120KD，免疫沉淀(IP)結合 WB和考馬斯亮藍染色顯示MG5在120KD處明顯富集，我們在120K

6、D處進行切膠并進行質譜分析(MALDI-TOF/MS),結果表明MG5很可能是LAMP2。WB結果顯示，商品化的LAMP2抗體的確可以識別MG5抗體在120KD處的IP產物。由于LAMP2蛋白具有 A，B，C三個亞型，我們進一步需要確定MG5對應的是哪一種亞型。我們在293T細胞中瞬時轉染過表達LAMP2A和LAMP2B，WB結果顯示商品化的LAMP2抗體既可以識別LAMPA，也可以識別LAMP2B，但MG5抗體只能識別LAMP2A，表

7、明MG5對應的蛋白是LAMP2A。LAMP2A的過表達和干擾實驗進一步證實MG5抗體識別的是LAMP2A蛋白。免疫細胞熒光實驗表明MG5呈顆粒狀細胞器定位，并與溶酶體示蹤劑共定位于溶酶體。以上結果證實，MG5是LAMP2A。
　　四、LAM P2A在胃癌細胞增殖和生存中的作用及相關機制
　　蛋白組學篩選提示，細胞增殖調節(jié)蛋白RhoE可以和LAMP2A和HSC70結合，提示它是伴侶分子介導的自噬（CMA）的底物，下調LAMP2

8、A(CMA也將下調)可能會上調RhoE而抑制增殖。結果證實，下調CMA的限速分子LAMP2A引起胃癌細胞的增殖減慢，同時伴有RhoE的表達增加；RhoE過表達可以直接抑制胃癌細胞的增殖；下調RhoE可以部分逆轉LAMP2A下調引起的增殖抑制。RhoE是CMA(伴侶分子介導的自噬)的底物。結果提示，通過下調LMAP2 A抑制CMA活性后其底物蛋白RhoE水平上調，是引起胃癌細胞增殖減慢的部分原因。我們的實驗第一次闡明了CMA調控胃癌細胞增

9、殖的分子機制，并發(fā)現(xiàn)了一個新的CMA底物蛋白RhoE。另外，我們還研究了LAMP2A在胃癌細胞氧化應激中的作用。發(fā)現(xiàn)下調LMAP2A抑制CMA活性后，細胞對H2O2誘導的凋亡更加敏感，過表達DJ-1可以保護細胞免受過多的凋亡；進一步發(fā)現(xiàn)過度氧化的DJ-1是CMA的底物蛋白，CMA障礙時，過度氧化的DJ-1不能有效降解發(fā)生積聚，部分介導了氧化應激誘導的凋亡。提示正常的CMA可以有效清除過度氧化的DJ-1，從而維持胃癌細胞氧化應激時的生存。