黃精多糖干預去卵巢大鼠、骨髓間充質(zhì)干細胞及破骨細胞后microRNA的差異表達及機制研究.pdf

1、背景與目的:絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)由女性絕經(jīng)后卵巢功能減退、雌激素水平下降所致，易引起骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡失調(diào)，嚴重者易發(fā)生骨折，嚴重影響患者的健康。目前，治療骨質(zhì)疏松的藥物日益具有靶向性，抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)由細胞活性水平發(fā)展至信號通路水平，為骨質(zhì)疏松精確治療開辟了新的道路。黃精多糖是中藥黃精的主要成分，具有抗氧化、抗炎、降低血糖血脂及延緩衰老的作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖具有抗骨質(zhì)疏松的作用，但具體作用機制有待進一步

2、研究。microRNAs(miRNAs)具有調(diào)控細胞增殖、分化、脂肪代謝和激素分泌功能的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，具有高度保守性。研究表明miRNAs能調(diào)控骨質(zhì)疏松相關過程，包括成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞的分化過程，是某些骨代謝疾病的重要調(diào)控因子之一。因此，本實驗探討黃精多糖對去卵巢大鼠、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為成骨細胞和骨髓源性單核巨噬細胞誘導分化為破骨細胞過程中miRNAs表達譜的影響，為黃精多糖抗骨質(zhì)疏松的精確治療提供

3、研究基礎。
　　內(nèi)容:
　　1.通過摘除大鼠雙側(cè)卵巢建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察黃精多糖對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細胞中miRNA表達的影響。
　　2.通過誘導大鼠間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，觀察黃精多糖對大鼠間充質(zhì)干細胞向成骨分化過程中miRNA表達的影響。
　　3.通過誘導大鼠骨髓源性單核巨噬細胞向破骨細胞分化，觀察黃精多糖對大鼠骨髓源性單核巨噬細胞向破骨分化中miRNA表達的影響。
　　4.預測表達顯著下調(diào)

4、的rno-miR-1224靶基因，觀察黃精多糖基于Hippo信號通路對破骨細胞的影響。
　　方法:
　　1.摘除雌性大鼠雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松模型。(1)每周測量大鼠體重變化情況;(2)雙能X射線骨密度儀法測量各組大鼠全身骨密度(BMD);(3) Elisa法和分光光度法檢測大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、鈣(Ca)和磷(P)含量;(4) Micro-CT法觀察大鼠脛

5、骨干骺端顯微結(jié)構(gòu)變化情況;(5)全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)OVX組和H-PSP組原代離體骨髓基質(zhì)細胞，抽提RNA后進行miRNA芯片檢測。
　　2.建立大鼠BMSCs誘導向成骨細胞分化的細胞模型。(1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，顯微鏡下觀察P3代大鼠細胞形態(tài)變化情況;(2)MTT法檢測不同劑量黃精多糖對大鼠BMSCs細胞增殖的影響;(3)誘導21d后，觀察各組堿性磷酸酶(ALP)染色情況;(4)誘導28d后，各組細胞進行茜素紅染色，觀察礦

6、化變化情況;(5)誘導7/14/21d，qRT-PCR法檢測成骨相關基因ALP，Runx2，OCN mRNA表達情況;(6)以25mg/L黃精多糖誘導21d提取的RNA進行miRNA芯片檢測。
　　3.建立大鼠原代骨髓源性巨噬細胞誘導向破骨細胞分化的細胞模型。(1)原代大鼠骨髓源性巨噬細胞的培養(yǎng)，顯微鏡下觀察原代大鼠BMMs形態(tài)變化情況;(2)誘導7d，觀察TRAP染色結(jié)果;(3)誘導7d，提取各組細胞RNA進行miRNA芯片檢測

7、。
　　4.(1) mirPath v.3預測rno-miR-1224調(diào)控的靶基因;(2) Western-blot法檢測0、15、30、60min四個時間點黃精多糖對Limd1、Mst1、Lats1、TAZ、TEAD3、CTGF蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:
　　1.(1)OVX組大鼠體重較Sham組顯著增加，給藥4周后，H-PSP組大鼠體重較OVX組顯著降低，給藥8周后，H，M-PSP組大鼠體重較OVX組顯著降低;(

8、2) OVX組大鼠全身骨密度較Sham組顯著降低，給藥8周后，H-PSP組骨密度較OVX組顯著增加;(3) OVX組大鼠血清ALP、OC、TRAP、Ca和P較Sham組均顯著增加，給予不同劑量黃精多糖后，H-PSP組ALP、TRAP和P含量較OVX組顯著降低，H，M-PSP組OC含量顯著降低，黃精多糖各劑量組Ca含量顯著降低;(4)黃精多糖各劑量組BV/TV、Tb.N和Tb.Th等指標較OVX組均有不同程度增加，Tb.Sp降低;(5)

9、microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達差異的miRNAs有15個，明顯表達上調(diào)的有6個，明顯表達下調(diào)的有9個。
　　2.(1)大鼠BMSCs生長呈長梭形，極性排列，成骨誘導分化后呈短梭形，體積變大;(2) MTT法檢測細胞增殖情況，各劑量黃精多糖組所測OD值無顯著差異;(3) ALP染色呈深色塊狀，細胞膜和細胞胞漿呈藍黑色;(4)25mg/L黃精多糖組礦化結(jié)節(jié)數(shù)較對照組顯著增多，呈深紅色;(5)不同劑量黃精多糖能顯著提高成骨分

10、化相關基因ALP、COL和OCNmRNA表達;(6) microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達顯著下調(diào)的miRNA有3個。
　　3.(1) TRAP染色胞漿呈紅色，可見空泡，一胞多核，煎雞蛋樣成熟破骨細胞情況;(2) microRNA微陣列芯片分析結(jié)果顯示表達有差異的miRNA有27個，明顯表達上調(diào)的有3個，明顯表達下調(diào)的有24個。
　　4.(1)預測miR-1224調(diào)控的靶基因為Limd1;(2) Limd1在30、60

11、min蛋白表達顯著減少，Mst1、Lats1在30、60min表達減少，TAZ在60min上顯著減少，TEAD3在30、60min相對減少，CTGF在15min表達顯著減少。
　　結(jié)論:
　　(1)黃精多糖可以抵抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨量的下降，具有抗骨質(zhì)疏松的作用;
　　(2)miRNA的表達對調(diào)控在體大鼠骨量，骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導為成骨細胞和骨髓源性巨噬細胞分化為破骨細胞三個過程有重要作用;
　　(3) m