Sterile-20激酶MINK1調(diào)控血小板功能并參與止血和血栓形成的機制研究.pdf

1、血小板在生理止血和血栓形成中扮演了重要角色，血小板的功能不足會導致出血，而血小板過度活化則會引起血栓性疾病。因此對血小板活化分子機理的深入研究，能夠闡明出血或血栓性疾病的發(fā)病機制，并為該類疾病尋求新的治療靶點和策略。在血小板活化過程中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)作為重要的信號通路節(jié)點分子，參與調(diào)控血小板粘附、釋放、聚集等各項功能，以促進血栓的形成。經(jīng)典的MAPK通路是包含三個激酶的級聯(lián)信號反應(yīng)，MAP3K磷酸化激活MAP2K，MAP

2、2K再磷酸化激活MAPK。然而，在血小板信號網(wǎng)絡(luò)中對MAPK通路具體的細致調(diào)控還不清楚。以往研究表明，Sterile-20激酶在信號通路中能夠扮演MAP4K的角色來調(diào)控MAPK通路的活化。Sterile-20激酶超家族根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為兩大家族:p21活化激酶(PAK)家族和生發(fā)中心激酶(GCK)家族。MINK1屬于GCKⅣ亞家族，在2000年被首次報道，在多種細胞活動過程中發(fā)揮重要作用，并能夠作為MAP4K參與調(diào)控Ras致癌基因誘導的卵巢

3、上皮細胞生長抑制以及T細胞發(fā)育過程中的陰性選擇。MINK1在止血與血栓領(lǐng)域的作用在此之前未見報道，鑒于MAPK通路在血小板活化以及血栓形成中的作用，我們提出假設(shè):MINK1能夠通過調(diào)控MAPK來介導血小板活化，并參與止血和血栓形成過程。
　　本研究利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，首次研究了MINK1在血小板功能，止血以及血栓形成中的作用。結(jié)果可以概括為以下幾點:
　　(1)在小鼠出血實驗中，MINK1敲除小鼠尾部出血時間明顯延長，說明M

4、INK1的缺失使得小鼠止血功能受損。
　　(2)在三氯化鐵誘導的腸系膜動脈血栓模型中，MINK1敲除小鼠的動脈堵塞時間顯著延長，兩倍于野生型小鼠。我們通過體外全血微灌流實驗?zāi)M血栓形成，發(fā)現(xiàn)動脈流速條件下，MINK1缺失血小板在膠原表面形成的血栓面積明顯減小，證明MINK1對血栓形成的正向促進作用依賴于其在血小板中發(fā)揮的作用。
　　(3)在對血小板各項功能進行檢測后發(fā)現(xiàn)，MINK1的缺失不影響血小板在膠原表面的粘附，然而當用

5、低濃度膠原和凝血酶刺激血小板發(fā)生聚集時，MINK1的缺失使得血小板的聚集水平顯著降低，并且伴隨有致密顆粒的釋放障礙，但是血小板α顆粒的釋放以及血栓烷A2的合成并不受MINK1缺失的影響。另外，MINK1缺失血小板在纖維蛋白原表面的鋪展面積較野生型血小板明顯減小，但是其血塊回縮功能則表現(xiàn)正常。
　　(4)當繼發(fā)釋放的ADP被apyrase水解后，野生型血小板與MINK1缺失血小板在聚集和鋪展功能上的差異基本消失，并且，外源性補充AD

6、P能夠使MINK1缺失血小板的聚集和鋪展功能恢復到正常水平。因此，MINK1的缺失導致的ADP分泌減少是血小板聚集和鋪展功能發(fā)生障礙的原因。
　　(5)在分子機制研究方面，我們發(fā)現(xiàn)MINK1的缺失不影響整合素αⅡbβ3的由內(nèi)向外和由外向內(nèi)信號本身，而在低濃度膠原和凝血酶所誘導的聚集反應(yīng)中，MINK1的缺失使得ERK，p38和Akt的磷酸化水平顯著降低，且MINK1對上述分子的調(diào)控不依賴于繼發(fā)釋放的ADP以及整合素αⅡbβ3介導的由

7、外向內(nèi)信號。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MINK1也能夠調(diào)控ERK和p38上游的MAP2K分子—MEK1/2和MKK3/6的活化。在用ERK抑制劑U0126或p38抑制劑SB203580孵育血小板后發(fā)現(xiàn)，它們能夠消除野生型血小板與MINK1缺失血小板在應(yīng)對低濃度膠原和凝血酶刺激時聚集和致密顆粒釋放上的差異，說明MINK1缺失導致的ERK和p38磷酸化水平的降低，是致密顆粒釋放減少以及聚集受損的原因。
　　綜上所述，MINK1是參與血小板活化以