慢性乙醇中毒誘導小鼠大腦皮質神經細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 據報道世界衛(wèi)生組織估計全世界有20多億人飲用酒精性飲料及7.63億人診斷為酒精性相關性疾病、紊亂癥。乙醇及其在體內代謝的一系列中間產物，對機體組織細胞都會產生直接或間接的毒性作用。慢性乙醇中毒是指長期、過量飲酒引起的實質器官病理變化及行為障礙性疾病，導致腦重量變小，大腦萎縮，腦額葉前皮質和其他腦區(qū)神經元及膠質細胞密度降低，細胞和白質的缺失，以及永久的認知功能障礙，但其具體機制目前還不清楚。caspase-3是一種天

2、冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase），正常情況下存在于胞質中。當死亡信號傳遞至細胞內后，通過一系列級聯反應激活caspase蛋白家族，caspase-3的激活（裂解成p11、p17、p19、p20片段）后，進一步傳遞給后續(xù)級聯反應至細胞核內，促使細胞發(fā)生凋亡。本研究在建立小鼠慢性乙醇中毒的動物模型基礎上，應用TUNEL法檢測慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質神經細胞凋亡變

3、化，及應用免疫組化和Western blot技術檢測慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質神經細胞caspase-3和NSE的表達，探討慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質神經細胞損傷、細胞凋亡的病理生理機制。
　　 實驗材料與方法：
　　 一、動物模型的建立及分組
　　 健康成年（8～9周齡）清潔級昆明系雄性小鼠48只，體質量30～42g，隨機分為8組，每組6只。其中第一組為90天正常對照組，第二組為90天10％乙醇（V/V）實驗組，第

4、三組為90天20％乙醇（V/V）實驗組，第四組為90天30％乙醇（V/V）實驗組，第五組為180天正常對照組，第六組為180天10％乙醇（V/V）實驗組，第七組為180天20％乙醇（V/V）實驗組，第八組為180天30％乙醇（V/V）實驗組。適應性喂養(yǎng)5天后正常對照組給予飲用純凈水自由飲用，慢性乙醇中毒自由飲用。每日觀察各組動物喂養(yǎng)情況及行為變化。90天組飼養(yǎng)90天，180天組飼養(yǎng)180天。
　　 各組實驗動物到慢性乙醇中毒動物

5、模型終止時間取材。動物取材前，采小鼠尾靜脈血0.2ml測血乙醇濃度。取材時，乙醚吸入麻醉后迅速斷頭，取出整個腦組織，去除小腦和腦干，取大腦以備HE染色、免疫組織化學染色、TUNEL法檢測細胞凋亡和Western blot檢測應用。
　　 二、實驗方法
　　 應用頂空氣相色譜法檢測各組小鼠血乙醇濃度，應用免疫組織化學檢測各組小鼠大腦皮質神經細胞NSE的表達變化，應用TUNEL法檢測各組小鼠大腦皮質神經細胞凋亡變化，應用免疫

6、組織化學檢測各組小鼠大腦皮質神經細胞procaspase-3的表達變化，及應用Western blot技術檢測各組小鼠大腦皮質procaspase-3和active caspase-3的表達變化。以正常對照組小鼠大腦皮質作對照，顯微鏡×400倍下，在大腦皮質區(qū)隨機選取10個視野，計數細胞總數、陽性細胞數及陽性細胞率。應用Motic Image Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計算各組平均積分光密度，測得數據用均數±標準差（x±s）表

7、示。用SPSS13.0 for Windows進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 在小鼠慢性乙醇中毒制模終止前各慢性乙醇中毒組小鼠出現明顯的慢性乙醇中毒表現，較正常對照組小鼠毛發(fā)失去光澤、雜亂、稀疏，精神萎靡、易激惹，體重減輕。隨著飲酒濃度的增加，90天組內正常對照組與20％、30％乙醇組間小鼠體重增長值差異有統(tǒng)計學差異（P<0.05），而與10％乙醇組間體重增長值差異無統(tǒng)計學意義

8、（P>0.05）；180天組內正常對照組與10％、20％、30％乙醇組間體重增長值差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組小鼠血乙醇濃度未檢出，隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，慢性乙醇中毒組小鼠血乙醇濃度也增大，各慢性乙醇中毒組小鼠血乙醇濃度與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。慢性乙醇中毒組小鼠大腦質軟，組織腫脹，腦溝變淺，大腦皮質變薄。慢性乙醇中毒實驗組小鼠大腦切片HE染色顯示皮質神經細胞嗜伊紅染色增強，軸突腫脹，

9、尼氏體邊聚，腦實質內神經細胞、血管周間隙增寬，有的神經細胞核深染，染色質固縮，胞質濃縮，可見噬神經細胞現象。隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質神經細胞NSE表達陽性細胞數逐漸減少，NSE陽性細胞率逐漸降低，慢性乙醇中毒各組與正常對照組間小鼠大腦皮質神經細胞NSE陽性細胞數、陽性細胞率及平均積分光密度差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。TUNEL法檢測顯示隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質神經細胞TUNEL陽性細

10、胞數逐漸減少，陽性細胞率逐漸降低，慢性乙醇中毒各組與正常對照組間TUNEL陽性細胞數、陽性細胞率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常小鼠大腦皮質神經細胞表達procaspase-3，隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質神經細胞procaspase-3表達陽性細胞數逐漸減少，procaspase-3陽性細胞率逐漸降低，90天組內正常對照組與20％、30％乙醇組間procaspase-3陽性細胞數、陽性細胞率及平均積分光密度的

11、差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而與10％乙醇組間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），180天組內的各組間統(tǒng)計學分析結果和90天組內統(tǒng)計學分析結果一樣。Western blot檢測結果顯示正常對照組小鼠大腦皮質有procaspase-3（32kD）陽性條帶無active caspase-3（17kD）陽性條帶，而各慢性乙醇中毒組小鼠大腦皮質有procaspase-3（32kD）、active caspase-3（17kD）兩條陽性條帶

12、，且隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質表達procaspase-3的陽性條帶逐漸減弱，而表達active caspase-3的陽性條帶逐漸增強，90天組內各慢性乙醇中毒組與正常對照組間procaspase-3、active caspase-3陽性條帶間平均灰度值的差異都有統(tǒng)計學意義（P<0.05），180組內的各組間統(tǒng)計學分析結果和90天組內統(tǒng)計學分析結果一樣。
　　 結論：
　　 1、慢性乙醇中毒導致小鼠