慢性乙醇中毒誘導(dǎo)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 據(jù)報道世界衛(wèi)生組織估計全世界有20多億人飲用酒精性飲料及7.63億人診斷為酒精性相關(guān)性疾病、紊亂癥。乙醇及其在體內(nèi)代謝的一系列中間產(chǎn)物，對機體組織細胞都會產(chǎn)生直接或間接的毒性作用。慢性乙醇中毒是指長期、過量飲酒引起的實質(zhì)器官病理變化及行為障礙性疾病，導(dǎo)致腦重量變小，大腦萎縮，腦額葉前皮質(zhì)和其他腦區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞密度降低，細胞和白質(zhì)的缺失，以及永久的認知功能障礙，但其具體機制目前還不清楚。caspase-3是一種天

2、冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase），正常情況下存在于胞質(zhì)中。當(dāng)死亡信號傳遞至細胞內(nèi)后，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)激活caspase蛋白家族，caspase-3的激活（裂解成p11、p17、p19、p20片段）后，進一步傳遞給后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)至細胞核內(nèi)，促使細胞發(fā)生凋亡。本研究在建立小鼠慢性乙醇中毒的動物模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用TUNEL法檢測慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡變

3、化，及應(yīng)用免疫組化和Western blot技術(shù)檢測慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞caspase-3和NSE的表達，探討慢性乙醇中毒小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞損傷、細胞凋亡的病理生理機制。
　　 實驗材料與方法：
　　 一、動物模型的建立及分組
　　 健康成年（8～9周齡）清潔級昆明系雄性小鼠48只，體質(zhì)量30～42g，隨機分為8組，每組6只。其中第一組為90天正常對照組，第二組為90天10％乙醇（V/V）實驗組，第

4、三組為90天20％乙醇（V/V）實驗組，第四組為90天30％乙醇（V/V）實驗組，第五組為180天正常對照組，第六組為180天10％乙醇（V/V）實驗組，第七組為180天20％乙醇（V/V）實驗組，第八組為180天30％乙醇（V/V）實驗組。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后正常對照組給予飲用純凈水自由飲用，慢性乙醇中毒自由飲用。每日觀察各組動物喂養(yǎng)情況及行為變化。90天組飼養(yǎng)90天，180天組飼養(yǎng)180天。
　　 各組實驗動物到慢性乙醇中毒動物

5、模型終止時間取材。動物取材前，采小鼠尾靜脈血0.2ml測血乙醇濃度。取材時，乙醚吸入麻醉后迅速斷頭，取出整個腦組織，去除小腦和腦干，取大腦以備HE染色、免疫組織化學(xué)染色、TUNEL法檢測細胞凋亡和Western blot檢測應(yīng)用。
　　 二、實驗方法
　　 應(yīng)用頂空氣相色譜法檢測各組小鼠血乙醇濃度，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞NSE的表達變化，應(yīng)用TUNEL法檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡變化，應(yīng)用免疫

6、組織化學(xué)檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞procaspase-3的表達變化，及應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)procaspase-3和active caspase-3的表達變化。以正常對照組小鼠大腦皮質(zhì)作對照，顯微鏡×400倍下，在大腦皮質(zhì)區(qū)隨機選取10個視野，計數(shù)細胞總數(shù)、陽性細胞數(shù)及陽性細胞率。應(yīng)用Motic Image Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)計算各組平均積分光密度，測得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表

7、示。用SPSS13.0 for Windows進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 在小鼠慢性乙醇中毒制模終止前各慢性乙醇中毒組小鼠出現(xiàn)明顯的慢性乙醇中毒表現(xiàn)，較正常對照組小鼠毛發(fā)失去光澤、雜亂、稀疏，精神萎靡、易激惹，體重減輕。隨著飲酒濃度的增加，90天組內(nèi)正常對照組與20％、30％乙醇組間小鼠體重增長值差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），而與10％乙醇組間體重增長值差異無統(tǒng)計學(xué)意義

8、（P>0.05）；180天組內(nèi)正常對照組與10％、20％、30％乙醇組間體重增長值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常對照組小鼠血乙醇濃度未檢出，隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，慢性乙醇中毒組小鼠血乙醇濃度也增大，各慢性乙醇中毒組小鼠血乙醇濃度與正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。慢性乙醇中毒組小鼠大腦質(zhì)軟，組織腫脹，腦溝變淺，大腦皮質(zhì)變薄。慢性乙醇中毒實驗組小鼠大腦切片HE染色顯示皮質(zhì)神經(jīng)細胞嗜伊紅染色增強，軸突腫脹，

9、尼氏體邊聚，腦實質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細胞、血管周間隙增寬，有的神經(jīng)細胞核深染，染色質(zhì)固縮，胞質(zhì)濃縮，可見噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象。隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞NSE表達陽性細胞數(shù)逐漸減少，NSE陽性細胞率逐漸降低，慢性乙醇中毒各組與正常對照組間小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞NSE陽性細胞數(shù)、陽性細胞率及平均積分光密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TUNEL法檢測顯示隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞TUNEL陽性細

10、胞數(shù)逐漸減少，陽性細胞率逐漸降低，慢性乙醇中毒各組與正常對照組間TUNEL陽性細胞數(shù)、陽性細胞率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞表達procaspase-3，隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞procaspase-3表達陽性細胞數(shù)逐漸減少，procaspase-3陽性細胞率逐漸降低，90天組內(nèi)正常對照組與20％、30％乙醇組間procaspase-3陽性細胞數(shù)、陽性細胞率及平均積分光密度的

11、差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與10％乙醇組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），180天組內(nèi)的各組間統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果和90天組內(nèi)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果一樣。Western blot檢測結(jié)果顯示正常對照組小鼠大腦皮質(zhì)有procaspase-3（32kD）陽性條帶無active caspase-3（17kD）陽性條帶，而各慢性乙醇中毒組小鼠大腦皮質(zhì)有procaspase-3（32kD）、active caspase-3（17kD）兩條陽性條帶

12、，且隨著飲酒濃度的增加和飲酒時間的延長，小鼠大腦皮質(zhì)表達procaspase-3的陽性條帶逐漸減弱，而表達active caspase-3的陽性條帶逐漸增強，90天組內(nèi)各慢性乙醇中毒組與正常對照組間procaspase-3、active caspase-3陽性條帶間平均灰度值的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），180組內(nèi)的各組間統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果和90天組內(nèi)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果一樣。
　　 結(jié)論：
　　 1、慢性乙醇中毒導(dǎo)致小鼠