家蠶BmVps4和BmVta1功能的初步研究.pdf

1、ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）蛋白質(zhì)復(fù)合物廣泛存在于真核生物中，在進(jìn)化上也是比較保守的，參與胞質(zhì)分裂、病毒出芽、自噬、質(zhì)膜損傷的修復(fù)、核膜重整、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等多種重要生命活動(dòng)，與癌癥、神經(jīng)退行性疾病也有密切關(guān)系。ESCRT復(fù)合物系統(tǒng)中的一個(gè)重要蛋白是ATP酶Vps4，常與其正調(diào)控因子Vta1一起，在ESCRT完成功能后負(fù)責(zé)解離這些復(fù)合物以重復(fù)利用。目前研究主

2、要在哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞中進(jìn)行，在家蠶等昆蟲(chóng)中的研究還比較少。本論文以Vps4和Vta1在家蠶中的同源基因及編碼蛋白為研究對(duì)象，進(jìn)行了初步的研究，主要結(jié)果如下：
　　1.用生物信息學(xué)方法，分析家蠶基因組信息，確認(rèn)了BmVps4、BmVta1的編碼基因（SGD中登錄號(hào)分別為BGIBMGA006243、BGIBMGA004694）。BmVps4、BmVta1分別編碼438、311個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子量分別為49 kDa、34 kDa。

3、BmVps4、BmVta1基因分別位于家蠶第6號(hào)和22號(hào)染色體上。BmVps4蛋白具有保守的MIT結(jié)構(gòu)域、AAA結(jié)構(gòu)域、β片層以及C端螺旋。BmVta1蛋白具有保守的MIT結(jié)構(gòu)域以及VSL結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)BmVps4和BmVta1在進(jìn)化上也是高度保守的。
　　2.采用PCR法克隆了BmVps4和BmVta1基因，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a(+)-BmVps4和pET-30a(+)-BmVta1，在大腸

4、桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)了BmVps4和BmVta1的重組蛋白。
　　3.用重組蛋白作為抗原免疫小鼠，獲得了分別抗BmVps4和BmVta1的多克隆抗血清，能夠特異性的檢測(cè)在大腸桿菌中表達(dá)的相應(yīng)重組蛋白及家蠶內(nèi)源蛋白，可以用來(lái)分析這兩個(gè)蛋白在家蠶不同發(fā)育階段及組織器官中的表達(dá)情況。
　　4.采用EGFP融合表達(dá)的方法，構(gòu)建基于昆蟲(chóng)表達(dá)載體pIB/V5-His的重組表達(dá)質(zhì)粒pIB-BmVps4-egfp、pIB-egf

5、p-BmVta1，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這2個(gè)重組蛋白均主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　5.應(yīng)用熒光定量PCR、RT-PCR及Western blot分析BmVps4和BmVta1在家蠶不同發(fā)育階段及不同組織器官中的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的變化。二者的基因在家蠶整個(gè)生活周期中均有轉(zhuǎn)錄，且在胚胎發(fā)育和變態(tài)發(fā)育期達(dá)到最高水平；BmVps4在受精卵中轉(zhuǎn)錄水平最高，是其在1齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量的4倍；BmVta1在蠶蛾中轉(zhuǎn)錄水平最高

6、，是其在1齡幼蟲(chóng)時(shí)的2倍。這兩種蛋白在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都有表達(dá)，特別在家蠶變態(tài)發(fā)育和胚胎發(fā)育階段有明顯的上調(diào)。因此，這兩個(gè)基因及其編碼蛋白可能在家蠶發(fā)育中發(fā)揮重要作用。另一方面，這兩個(gè)基因具有一定的組織器官表達(dá)特異性，在馬氏管、卵巢、精巢、神經(jīng)節(jié)、頭、脂肪體、中腸、絲腺、血淋巴中均有基因的轉(zhuǎn)錄，但在頭和血淋巴中基因轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高。雖然Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)蛋白在多種組織器官中的廣泛存在，但是二者都在卵巢和精巢

7、中表達(dá)量高，在頭部中表達(dá)量卻很少，在血淋巴中也沒(méi)有檢測(cè)到蛋白表達(dá)的信號(hào)，對(duì)這個(gè)現(xiàn)象我們正在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步的研究中。
　　6.采用RNAi技術(shù)探究BmVps4在家蠶變態(tài)發(fā)育階段的作用。將人工合成的siRNA片段注射進(jìn)入家蠶5齡第5天幼蟲(chóng)體內(nèi)，能夠明顯降低BmVps4的mRNA水平，并顯著的遲滯了變態(tài)發(fā)育的進(jìn)程。RNA干擾3天后，BmVps4基因的表達(dá)量下降了61％，相對(duì)于注射si-egfp的陰性對(duì)照組家蠶也下降了54%；家蠶

8、體重增長(zhǎng)率僅有未注射組家蠶的56%，相當(dāng)于注射si-egfp家蠶組的60%；化蛹時(shí)間也明顯延長(zhǎng)，比未注射組延長(zhǎng)50分鐘，比注射si-egfp的陰性對(duì)照組延長(zhǎng)了40分鐘。RNAi處理13天后，蠶蛹的體重和體長(zhǎng)均低于對(duì)照組家蠶，而且蠶繭明顯變小，繭絲較少。RNAi導(dǎo)致蠶蛾翅膀短小、伸展不開(kāi)的比例明顯升高，高達(dá)30%，是未注射組的3倍，是注射si-egfp組的2倍。這些結(jié)果說(shuō)明BmVps4在家蠶的變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的確發(fā)揮了重要的作用。
　

9、　7.用家蠶核型多角體病毒BmNPV感染家蠶 BmN細(xì)胞，采用熒光定量PCR探索了BmVps4和BmVta1的基因轉(zhuǎn)錄變化情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)， BmVps4的基因轉(zhuǎn)錄在病毒侵染后50、60、90分鐘階段有明顯的上調(diào)，但在50、60分鐘的上調(diào)程度要高于在90分鐘的上調(diào)程度；BmVta1則在20、60、90分鐘階段有明顯上調(diào)，但在90分鐘的上調(diào)程度要高于前2個(gè)時(shí)間點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)表明， BmVps4和BmVta1與BmNPV的感染