脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)幼鼠食物過(guò)敏模型免疫干預(yù)作用.pdf

1、研究目的：1.以 Balb/c小鼠脂肪組織體外分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ Adipose Derived Stem Cells, ADSC）并做鑒定及培養(yǎng)；2.構(gòu)建卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）致Balb/c幼鼠食物過(guò)敏模型，并利用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)其血清細(xì)胞因子表達(dá)；3.探討在致敏前期和致敏后期脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞注射移植對(duì)Balb/c幼鼠食物過(guò)敏的免疫干預(yù)作用,并比較兩組的療效有何不同。
　　方法：取無(wú)特定病原體

2、（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)別6周齡的Balb/c品系雄性小鼠，采用頸椎脫臼的方法處死小鼠，于超凈工作臺(tái)中無(wú)菌取小鼠附睪及其周圍部位的脂肪組織，使用眼科剪將其剪成小碎塊，然后加入Ⅰ型膠原酶消化，經(jīng)過(guò)濾去除未消化組織，離心后接種，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3-4代后得到純度較高的ADSC,進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定及CD44、CD29的表面抗體鑒定，鑒定后凍存以備移植使用。將32只3周齡Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為

3、4個(gè)組：空白對(duì)照組、過(guò)敏模型組，ADSC治療組，ADSC預(yù)防組，每組8只。利用卵清蛋白（OVA）建立 Balb/c幼鼠食物過(guò)敏動(dòng)物模型，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水作為對(duì)照， ADSC治療組在強(qiáng)化致敏后（即造模第15天）按每只小鼠給予1×106個(gè)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行細(xì)胞移植，ADSC預(yù)防組在第一次基礎(chǔ)致敏時(shí)（即造模第1天）進(jìn)行細(xì)胞移植，空白對(duì)照組及過(guò)敏模型組給予等量PBS作為對(duì)照。觀察各組小鼠相關(guān)的癥狀并進(jìn)行評(píng)分，最后一次激發(fā)致敏操作后處死小鼠，取

4、空腸組織0.5cm做HE染色，觀察不同分組小鼠病理有何改變，小鼠處死前摘眼球取血，利用 Luminex技術(shù)檢測(cè)血清中多種細(xì)胞因子的變化情況，檢測(cè)小鼠食物過(guò)敏血清細(xì)胞因子表達(dá)情況，并比較ADSC治療組及ADSC預(yù)防組的不同。
　　結(jié)果：1.體外成功分離了Balb/c小鼠的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)約2周可出現(xiàn)脂肪滴，經(jīng)過(guò)油紅O染色可呈現(xiàn)紅色；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)3周左右可出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)過(guò)

5、茜素紅染色可呈現(xiàn)紅色；ADSC陽(yáng)性表達(dá)CD44(98.92％)、CD29(99.78%)。
　　2.制備Balb/c幼鼠食物過(guò)敏模型。與空白對(duì)照組的小鼠相比，過(guò)敏模型組小鼠表現(xiàn)出比較顯著的過(guò)敏癥狀和體征，過(guò)敏模型組小鼠的癥狀評(píng)分平均值(3.13?0.64)明顯高于空白對(duì)照組(0.38?0.52)（P<0.05）；病理切片出現(xiàn)小腸絨毛水腫，大量淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并且IFN-γ，作為血清中Th1特征性代表因子，其含量

6、是降低的（P<0.05）；IL-4，作為Th2特征性代表因子，其含量是升高的（P<0.05）；過(guò)敏模型組其它細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23、MCP-1與對(duì)照組相比含量均升高，變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而IL-10、IL-13的含量與空白對(duì)照組對(duì)比也有所升高，但并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.與過(guò)敏模型組相比，ADSC治療組過(guò)敏癥狀評(píng)分平均值明顯降低（P<0.05）；病理切片腸

7、絨毛相對(duì)完整，炎細(xì)胞浸潤(rùn)量較少，ADSC治療組IFN-γ、IL-4含量變化也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中 ADSC治療組的 IFN-γ含量是升高的，IL-4的含量是降低的；其它細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23、MCP-1含量降低均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05),而 IL-10、IL-13含量變化同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05)。說(shuō)明ADSC移植對(duì)幼鼠食物過(guò)敏具有免疫調(diào)節(jié)作用。
　　4.ADS

8、C預(yù)防組過(guò)敏癥狀評(píng)分較過(guò)敏模型組分低（P<0.05）,但高于ADSC治療組；病理切片觀察較過(guò)敏組有緩解，細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-6、IL-22、IL-23含量升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余指標(biāo)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明ADSC治療組、ADSC預(yù)防組都能改善小鼠過(guò)敏癥狀，而 ADSC治療組較 ADSC預(yù)防組效果更好。
　　結(jié)論：
　　1.以小鼠脂肪組織體外可以成功制備、分離培養(yǎng)ADSC；

9、　　2. OVA可以建立3周齡Balb/c幼鼠食物過(guò)敏模型；
　　3.在致敏前期或致敏后期進(jìn)行ADSC移植對(duì)Balb/c幼鼠食物過(guò)敏均有免疫干預(yù)作用，可以降低食物過(guò)敏幼鼠的過(guò)敏癥狀評(píng)分，減輕腸粘膜過(guò)敏病理?yè)p傷程度，調(diào)高Th1細(xì)胞因子IFN-γ，調(diào)低Th2細(xì)胞因子IL-4等，對(duì)食物過(guò)敏幼鼠有免疫防治作用，致敏后期干細(xì)胞移植比致敏前期移植免疫調(diào)節(jié)效果更好。
　　4.腹腔移植ADSC可以減輕OVA誘導(dǎo)的幼鼠食物過(guò)敏，其機(jī)制可能與A