骨髓間充質(zhì)干細胞干預(yù)異種氣管移植免疫排斥反應(yīng)的實驗研究.pdf

1、第一部分 異種氣管移植動物模型的建立 目的:建立一種簡單的豚鼠-SD大鼠異種氣管移植動物模型，為下一步研究其免疫排斥反應(yīng)特點及干預(yù)措施奠定基礎(chǔ)，為解決臨床上供體氣管來源問題提供新方向。 方法:采用“加植法”建立了一種新型的短段(5個氣管環(huán))異種原位氣管移植動物模型，觀察術(shù)后受體存活時間、移植氣管在光鏡和電鏡下的病理組織學改變，初步分析其免疫排斥反應(yīng)特點。 結(jié)果:單人操作連續(xù)進行20例異種氣管移植，手術(shù)成功

2、率達100％(20/20)，受體手術(shù)時間(20.8±1.6)min，無重要手術(shù)并發(fā)癥。受體術(shù)后存活最短8.0d，最長12.5d，平均(10.O±1.3)d。移植氣管隨著時間延長逐漸出現(xiàn)管腔狹窄，粘膜上皮、粘膜下、外膜及軟骨逐漸出現(xiàn)不同程度淋巴細胞、嗜酸粒細胞、單核巨噬細胞的浸潤以及細胞凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論:以“加植法”建立的短段(5個氣管環(huán))異種氣管移植動物模型，術(shù)后移植段氣管的病理變化符合異種氣管移植免疫排斥反應(yīng)的一般特點，是一種

3、簡便、經(jīng)濟實用、穩(wěn)定可靠和易于復(fù)制的器官移植研究動物模型。 第二部分 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)、表型鑒定與標記 目的:探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的體外分離培養(yǎng)、表型鑒定和標記的方法，為迸一步研究MSCs干預(yù)異種氣管移植的免疫排斥做好準備。 方法:采用直接貼壁法分離培養(yǎng)MSCs；通過流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原CD90、CD45的表達率對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定；DAPI標記第3代

4、MSCs，觀察標記效率。 結(jié)果:體外培養(yǎng)的原代MSCs48h內(nèi)可見有少量貼壁細胞，7～10d左右達到90％匯合；流式細胞儀檢測第3代MSCs表面標記物CD90、CD45的陽性率分別為99.8％、6.8％，提示MSCs表達CD90而不表達CD45；用DAPI進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見幾乎所有MSCs均已被標記藍色熒光，提示DAPI標記法敏感性好，標記效率高。 結(jié)論:貼壁培養(yǎng)法是一種簡便易行的培養(yǎng)MSCs方法，操作簡單，

5、成功率高，可以作為培養(yǎng)SD大鼠MSCs的常規(guī)方法；DAPI標記可作為標記MSCs的一種有效手段。 第三部分 骨髓間充質(zhì)干細胞對異種氣管移植免疫排斥反應(yīng)的影響 目的:通過靜脈移植的方式將骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)輸入豚鼠-大鼠異種氣管移植后的受體，進一步研究異種氣管移植的排斥反應(yīng)特點及MSCs對其免疫干預(yù)作用，為解決臨床上氣管移植術(shù)后抗排斥問題提供新思路。 方法:實驗分成4組：A組(自體移植，n=17)；

6、B組(異種移植，n=20)；C組(異種移植+CsA，n=25)；D組(異種移植+MSCs，n=25)。記錄受體存活時間，觀察移植氣管病理組織學變化及氣管通暢度，流式細胞儀檢測外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的變化，移植氣管冷凍標本免疫熒光檢查IgG、IgM、C3的沉積，TUNEL法檢測移植物細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(AI)，生化分析儀檢測外周血肌酐(CREA)的變化。 結(jié)果:(1)異種移植后各組受體平均存活時間分別為：B組(

7、10.0±1.3)d、C組(17.1±2.7)d、D組(17.6±3.2)d，C、D組生存時間顯著長于B組(P＜0.01)。(2)各組移植氣管病理積分和通暢度的比較：異種移植后的各組與自體移植組相比，病理積分顯著增加(P＜0.01)而通暢度顯著下降(P＜0.01)，表現(xiàn)均為急性排斥改變：C、D組病理損害比B組輕，說明排斥反應(yīng)被減輕。(3)外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的比較：異種移植后的各組比自體移植組顯著增加，隨時間持續(xù)升高，

8、說明T細胞被激活參與了急性免疫排斥反應(yīng)；B組增加最明顯，C、D組低于B組，說明細胞免疫被抑制。(4)免疫熒光檢查結(jié)果比較：自體移植組未見IgG、IgM、C3的沉積，異種移植后的各組可見不同程度的IgG、IgM、C3沉積，說明體液免疫和補體系統(tǒng)參與了急性排斥反應(yīng)；B組IgG、IgM、C3復(fù)合物沉積最明顯，D組低于B組，說明MSCs對體液免疫和補體系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。(5)移植氣管細胞凋亡的比較：自體移植組AI顯著低于異種移植后的各組(P＜0

9、.01)，B組移植物AI最高與C、D組比較差異有顯著性(P＜0.01)。(6)外周血肌酐(CREA)的比較：C組隨時間的延長逐漸增加，其余3組則基本不變。 結(jié)論:細胞免疫、體液免疫均參與了豚鼠-大鼠異種氣管移植的急性排斥反應(yīng)；靜脈移植MSCs可明顯延長異種氣管移植受體的存活時間，增加移植氣管通暢度，抑制細胞凋亡，減輕免疫排斥反應(yīng)；MSCs可能通過對免疫細胞和補體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等多方面因素干預(yù)免疫排斥反應(yīng)；MSCs抗排斥效力與CsA相