RNA干擾Pael-R基因表達(dá)對(duì)PD模型細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、帕金森病(PD)是第二大類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其重要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元凋亡變性。引起多巴胺神經(jīng)元凋亡的原因十分復(fù)雜，至今仍未徹底明了，但普遍認(rèn)為與遺傳缺陷和/或環(huán)境毒素作用有關(guān)。 現(xiàn)已確定13個(gè)PD相關(guān)的基因，并證實(shí)其中5個(gè)基因(Parkin，DJ-1，α-synuclein，PINK1、LRRK2)的遺傳突變分別導(dǎo)致了家族性PD的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)受損導(dǎo)致的胞內(nèi)異常蛋白聚集可能是多

2、巴胺神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素之一，而Parkin基因編碼的Parkin蛋白作為UPS中重要的E3連接酶，其與神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白聚集進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡的過(guò)程密切相關(guān)，因此Parkin蛋白及其毒性底物也隨之成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，Parkin蛋白在細(xì)胞中的作用底物主要有五種： Pael-R(Parkin相關(guān)內(nèi)皮素受體樣受體)，α-synuclein，Synphilin-1，CDCrel-1和cyclinE。Pael-R是B型內(nèi)皮素受體的同

3、源體，Pael-RmRNA在紋狀體和黑質(zhì)的分布最為豐富；Pael-R蛋白若過(guò)度表達(dá)會(huì)變得不溶，并且在細(xì)胞內(nèi)異常聚積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白反應(yīng)，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。它的代謝依賴(lài)于Parkin蛋白介導(dǎo)的泛素化和蛋白酶體降解。在常染色體隱性遺傳青少年型帕金森病(AR-JP)患者中，由于Parkin基因突變導(dǎo)致Parkin蛋白的E3酶活性喪失，致其毒性底物如Pael-R、α-Sp22在胞內(nèi)大量聚集，最終引起細(xì)胞凋亡。因此推測(cè)，在Parkin基因

4、突變的情況下如果下調(diào)Pael-R表達(dá)可能會(huì)減輕后者異常聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，從而延緩細(xì)胞凋亡。 同時(shí)許多證據(jù)顯示，環(huán)境毒素?fù)p傷亦參與了多巴胺能神經(jīng)元凋亡變性的過(guò)程，這可能是引發(fā)PD的另一重要發(fā)病機(jī)制。魚(yú)藤酮作為一種廣泛使用的農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞和動(dòng)物模型都能較好地復(fù)現(xiàn)PD的癥狀及病理改變，出現(xiàn)選擇性的多巴胺能神經(jīng)元凋亡變性，因此被普遍用來(lái)建立環(huán)境毒素?fù)p傷的PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，但其具體機(jī)制一直未完全闡述清楚。Pael-R

5、與這條凋亡途徑有無(wú)關(guān)系，下調(diào)Pael-R表達(dá)能否減輕細(xì)胞凋亡目前尚未見(jiàn)有研究報(bào)導(dǎo)。 為此，本研究擬以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PCl2在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)分化后作為多巴胺能神經(jīng)元替代細(xì)胞，對(duì)所得的細(xì)胞分兩種方式進(jìn)行處理：一方面構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，干擾該細(xì)胞內(nèi)源性Parkin的表達(dá)，建立Parkin抑制的PD細(xì)胞模型；另一方面以魚(yú)藤酮處理細(xì)胞，建立環(huán)境毒素?fù)p傷的PD細(xì)胞模型。在此基礎(chǔ)上再構(gòu)建RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)染兩種不同的細(xì)

6、胞模型，下調(diào)Pael-R的表達(dá)，同時(shí)分別設(shè)置未轉(zhuǎn)染RNAi表達(dá)載體的空白對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Pael-R mRNA表達(dá)、Western Blot檢測(cè)細(xì)胞Pael-R蛋白表達(dá)、Hoechst 33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡、MTT檢測(cè)細(xì)胞活性及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。以此探討在Parkin基因受抑制時(shí)和魚(yú)藤酮毒素?fù)p傷時(shí)下調(diào)Pael-R表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為PD的神經(jīng)保護(hù)治療提供參考。 本研究發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)源性Parki