人端粒酶hTERT可誘導RNAi系統(tǒng)的建立及其對TREx-hela細胞生長狀態(tài)的影響.pdf

1、端粒(telomere)是真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結構，對維持染色體穩(wěn)定性和DNA完整復制具有重要作用。端粒酶是一種能以自帶RNA為模板，逆轉錄合成端粒DNA并加于染色體末端的核糖核蛋白。端粒酶調節(jié)亞單位hTERT對端粒酶活性有限速效應。端粒酶延長端粒重復片段能阻止端粒長度隨細胞分裂逐漸縮短，維持染色體穩(wěn)定，使細胞具有永生化特性。目前研究表明端粒酶不但和機體衰老有關，也可能與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重大關系。 RNA

2、干擾(RNAinterference，RNAi)作用是生物體內的一種通過雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關閉特異性序列的基因表達或使其沉默的過程。目前RNA干擾技術在基因功能分析、抗腫瘤和抗病毒的方面有著十分廣泛的應用前景，被Science雜志評為2002年度世界十大科學成就之首。 RNA干擾技術可為基因功能研究提供重要的信息，但這種信息只是“全或無”的。在很多情況下，需要研究

3、基因在不同表達水平上對細胞的影響，因此需要一個可以調控的RNA干擾系統(tǒng)來解決這個問題。Tet-on可誘導性RNAi干擾系統(tǒng)含有可以被tet抑制子(tetrepressor，TR)和四環(huán)素調節(jié)的Hl/TO啟動子。在表達TR的細胞中，啟動子被抑制，通過加入四環(huán)素或者類似物到培養(yǎng)基中，可以解除抑制作用，從而產生RNA干擾效應。 在本課題中，首先建立了含有可以被tet抑制子TR和四環(huán)素調節(jié)的Hl/TO啟動子的Tet-on可誘導性RNA

4、干擾系統(tǒng)。在此基礎上構建針對hTERT的可誘導性RNA干擾系統(tǒng)，建立了可誘導性沉默hTERT的細胞株，并且初步探討了端粒酶活性下降對TREx-Hela細胞株在細胞增殖和凋亡方面的影響。 本課題建立的可誘導性沉默hTERT的RNA干擾系統(tǒng)，為進一步研究端粒酶與細胞增殖調控之間的關系提供了基礎。 第一章構建可誘導性沉默hTERT的重組體 方法：1.根據(jù)NCBI提供的Hl啟動子序列，設計tet-on四環(huán)素誘導性H

5、1啟動子，即在Hl啟動子的TATA盒兩側加上四環(huán)素操作子TetO2，并在合成的序列兩端加上SpeI和NcoI的酶切位點。酶切RNAi載體psiRNA-hHlneo，插入tet-on四環(huán)素誘導型Hl啟動子序列替換原來的Hl啟動子。tet-on可誘導性RNAi載體psiRNA-hHl/TOneo構建完成。 2.根據(jù)NCBI提供的hTERT基因序列，并對目的序列進行篩選，將選出的序列在NCBI進行BLAST比對，選定3組RNA干擾片

6、段。合成后退火，分別連接到psiRNA-hHl/TOneo中，沉默端粒酶催化亞基hTERT的tet-on可誘導性RNAi載體psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA構建完成。 結果：1.通過酶切鑒定和測序分析，tet-on可誘導性RNAi載體psiRNA-hH1/TOneo啟動子序列與設計序列一致。 2.通過酶切鑒定和測序分析，插入psiRNA-hH1/TOneo的3段shDNA序列與設計序列一致。

7、 第二章建立可誘導沉默hTERT的TREx-hela細胞株 以及檢測方法：1.將構建好的psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3分別轉染入表達TR的TREx-hela細胞，用G418篩選陽性細胞克隆。 2.用半定量RT-PCR檢測各組細胞hTERT的轉錄后水平，并對其端粒酶活性進行檢測。 結果：1.建立了分別穩(wěn)定轉染psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3的TREx-he

8、la細胞株。 2.RT-PCR和端粒酶活性檢測結果顯示3個細胞株中，未誘導組細胞hTERT的mRNA含量未見下降，端粒酶活性未見降低；而誘導組細胞hTERT的mRNA含量下降，端粒酶活性降低。 第三章hTERT沉默對TREx-hela細胞增殖和凋亡的影響 方法：1.細胞的處理：3組細胞分別設立誘導組和未誘導組，誘導組加1ug/ml四環(huán)素誘導。 2.MTT法檢測誘導組和未誘導組以及對照組的增殖情況。

9、 3.Hochest33342染色觀察不同組細胞的凋亡發(fā)生情況。 4.流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡發(fā)生情況。 結果：1.MTT檢測結果顯示：3個細胞株中未誘導組細胞增殖能力未見明顯改變；而誘導組細胞增殖后期有減緩趨勢。 2.Hochest33342染色及流式細胞儀檢測結果示：各組細胞凋亡率無明顯差別。 結論1.構建了具有可被四環(huán)素誘導的tet-on可誘導性RNAi載體psiRNA-hHl