腺病毒介導(dǎo)的HER2-siRNA聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌移植瘤的治療效應(yīng)及SPECT顯像監(jiān)測研究.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)Her2/neu的RNA干擾腺病毒載體包裝重組腺病毒，觀察重組腺病毒感染移植瘤并聯(lián)合化療藥物順鉑對(duì)人卵巢癌移植瘤的治療作用，并用131I-Herceptin作顯像劑，SPECT顯像活體監(jiān)測腺病毒介導(dǎo)的HER2-siRNA對(duì)移植瘤內(nèi)HER2表達(dá)的干擾效應(yīng)，為進(jìn)一步研究卵巢癌的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：①根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)篩選出干擾效率滿意的HER-2/neu-shRNA序列，構(gòu)建及鑒定特異性的HER2-s

2、iRNA腺病毒載體及一條隨機(jī)序列的陰性對(duì)照腺病毒載體。②將上述載體經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒的包裝，并通過Adeno-X?Virus Purification Kit方法純化腺病毒，運(yùn)用終點(diǎn)稀釋法測定腺病毒滴度。③卵巢癌SKOV-3細(xì)胞接種BALB/c裸鼠后隨機(jī)分組進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)：瘤內(nèi)及瘤周注射特異性的HER2-siRNA腺病毒（Ad-HER2-RNAi組）、陰性腺

3、病毒（NC組）及PBS（CON組），檢測各組瘤體大小、瘤體重量、免疫組化測定各組HER2蛋白表達(dá)，利用131I-曲妥珠單克隆抗體（Herceptin）分別對(duì)荷卵巢癌移植瘤裸鼠進(jìn)行SPECT放射免疫顯像，研究裸鼠間隔15天的兩次重復(fù)顯像、不同劑量的131I-Herceptin顯像變化及計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組腫瘤/本底（T/B）比值。④荷卵巢癌移植瘤裸鼠隨機(jī)分五組進(jìn)行聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)：特異性的HER2-siRNA腺病毒和順鉑（Ad-HER2-RNAi+D

4、DP組）、特異性的HER2-siRNA腺病毒和生理鹽水（Ad-HER2-RNAi組）、PBS和順鉑（DDP組）、陰性腺病毒和生理鹽水（NC組）、PBS和生理鹽水（CON組），每組的DDP和生理鹽水是腹腔注射給藥，其余為瘤內(nèi)及瘤周注射。檢測各組裸鼠體重、瘤體大小、瘤體重量、免疫組化測定各組 HER2蛋白表達(dá)，利用131I-Herceptin對(duì)每組裸鼠進(jìn)行SPECT放射免疫顯像，分析圖像變化，計(jì)算各組腫瘤/本底（T/B）比值。
　　結(jié)

5、果：①成功構(gòu)建 HER2-siRNA干擾序列及隨機(jī)序列的腺病毒穿梭質(zhì)粒，測序證實(shí)序列正確。②重組腺病毒成功包裝，獲得了高滴度1×1011 PFU/mL的腺病毒。③Ad-HER2-RNAi組移植瘤與CON組和NC組相比，平均瘤體積、瘤體重量均明顯減?。≒＜0.05）；免疫組化結(jié)果亦證實(shí) Ad-HER2-RNAi組 HER2蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)；各組裸鼠經(jīng)尾靜脈注射131I-Herceptin后1h即可見移植瘤部位顯影，瘤體影像隨時(shí)間延長顯影

6、逐漸清晰，間隔15d裸鼠重復(fù)顯像無明顯差異，不同劑量顯像劑對(duì)圖像無明顯影像，因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇中等劑量7.4MBq的131I-Herceptin作為每次顯像用量；比較各時(shí)間點(diǎn)T/B值及經(jīng)組織厚度校正后的T/B值，Ad-HER2-RNAi組與CON組和NC組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。④聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與CON組和NC組比較，Ad-HER2-RNAi組和DDP組和Ad-HER2-RNAi+DDP組裸鼠移植瘤的平均瘤體積

7、和重量明顯下降（均P＜0.01），其中以后者更明顯。免疫組化結(jié)果顯示上述三組 HER2蛋白的表達(dá)均下調(diào)，聯(lián)合用藥組更明顯。SPECT顯像結(jié)果示三組治療組各時(shí)間點(diǎn)T/B原始比值及T/B校正值均低于CON組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。Ad-HER2-RNAi+DDP組各時(shí)間點(diǎn)T/B原始比值與Ad-HER2-RNAi組和DDP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。經(jīng)校正后，除1h時(shí)間點(diǎn)外，其余各時(shí)間點(diǎn)聯(lián)合用藥組T/B校