NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌干細胞作用研究.pdf

1、目的：
　　1.探究特異性靶向PI3K的抑制劑NVP-BKM120對三陰性乳腺癌細胞系中普通細胞及相應干細胞的殺傷作用,觀察 NVP-BKM120對三陰性乳腺癌細胞系中干細胞生長、增殖等生物學特性的影響。
　　2.探究NVP-BKM120聯(lián)合特異性靶向mTOR的抑制劑NVP-RAD001對三陰性乳腺癌系中普通細胞及相應干細胞的殺傷作用,觀察 NVP-BKM120與NVP-RAD001雙靶向聯(lián)合對三陰性乳腺癌細胞系中干細胞生長

2、、增殖等生物學特性的影響。
　　3.探究NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對裸鼠干細胞移植瘤生長增殖的影響，為臨床雙靶向聯(lián)合治療三陰性乳腺癌提供依據。
　　方法：
　　1.體外細胞學實驗部分：通過采用無血清干細胞培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)、富集三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、CAL51中的干細胞，并通過流式細胞儀檢測其中ESA+CD44+CD24-/low亞群比例。通過MTT分析法檢測常規(guī)培養(yǎng)條件以及懸浮培養(yǎng)條件

3、下，NVP-BKM120單藥、NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌細胞系中普通細胞及其干細胞的生長增殖抑制作用；通過計算藥物作用聯(lián)合指數分析研究 NVP-BKM120與 NVP-RAD001是否具有協(xié)同增效作用；通過耐藥細胞平板克隆實驗檢測 NVP-BKM120單藥、NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌細胞克隆形成能力的影響；通過球囊形成抑制實驗檢測懸浮培養(yǎng)條件下，NVP-BKM120單藥或N

4、VP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌干細胞球囊形成能力的影響；通過免疫蛋白印跡法檢測NVP-BKM120單藥或聯(lián)合 NVP-RAD001對三陰性乳腺癌細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路中關鍵節(jié)點的蛋白活化水平的影響。
　　2.裸鼠干細胞移植瘤實驗：通過無血清懸浮培養(yǎng)富集三陰性乳腺癌干細胞，建立裸鼠三陰性乳腺癌干細胞移植瘤模型并隨即分為4個實驗組，分別予以安慰劑、NVP-BKM120、NVP-RAD001或

5、聯(lián)合用藥，記錄給藥期間干細胞移植瘤體積變化以及裸鼠體重變化情況，觀察體內實驗條件下，藥物對三陰性乳腺癌干細胞的作用。
　　結果：
　　1.體外實驗條件下，NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌普通細胞及干細胞作用效果：通過對照組、NVP-BKM120組、NVP-RAD001組以及聯(lián)合用藥組之間的比較，在一定程度上，單藥NVP-BKM120或NVP-RAD001均能夠抑制三陰性乳腺癌普通細胞及其干細胞生長增

6、殖，并且隨藥物濃度的增大，其抑制作用增強。相比于普通細胞，干細胞對任一單藥具有耐藥性。通過與對照組、單藥組之間的比較，NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001能夠明顯抑制三陰性乳腺癌普通細胞及其干細胞的生長、增殖，減少普通細胞耐藥克隆形成與干細胞球囊形成，同時能夠明顯抑制 PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白pAKT、pS6表達水平進而抑制信號傳導。藥物聯(lián)合指數計算顯示NVP-BKM120與NVP-RAD001之間具有協(xié)同增效

7、作用。
　　2.體內實驗條件下，NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001對三陰性乳腺癌干細胞移植瘤的作用效果：通過對照組、NVP-BKM120組、NVP-RAD001組以及聯(lián)合用藥組之間的比較，在未明顯降低裸鼠體重的前提下，NVP-BKM120聯(lián)合NVP-RAD001能夠明顯減緩三陰性乳腺癌干細胞移植瘤的生長速度。
　　結論：
　　1. PI3K的抑制劑NVP-BKM120聯(lián)合靶向mTOR的抑制劑NVP-RAD00