SPD1672蛋白的關(guān)鍵功能域鑒定及其對(duì)不同血清型肺炎鏈球菌合成磷壁酸和毒力的影響研究.pdf

1、目的：
　　磷壁酸(Teichoic Acids)是革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁上一種的多糖聚合物，是細(xì)菌表面重要的抗原。spd1672基因是本課題組前期篩選出的一個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)基因，生物信息學(xué)分析顯示該基因在各種血清型肺炎鏈球菌中的高度保守性，其編碼產(chǎn)物具有O抗原連接酶、聚合酶結(jié)構(gòu)域。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SPD1672蛋白影響了2型肺炎鏈球菌D39菌株的毒力和磷壁酸合成，可能為磷壁酸合成酶，但其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域尚不清楚。因此本課題擬鑒定SPD1672蛋

2、白影響磷壁酸的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，并觀察其在其它血清型肺炎鏈球菌中是否也影響到磷壁酸合成及毒力。
　　方法：
　　首先通過替代失活的方法構(gòu)建肺炎鏈球菌D39(serotype2)、R6(serotype2)、203(serotype3)、TIGR4(serotype4)的spd1672基因缺陷菌株D39△1672、R6△1672、203△1672、TIGR4△1672，利用pEVP3質(zhì)粒構(gòu)建以上各菌株的周質(zhì)環(huán)extemal loop

3、4(EL4)缺陷菌株和spd1672基因的回復(fù)菌株，通過突變PCR技術(shù)構(gòu)建5個(gè)周質(zhì)環(huán)點(diǎn)突變回復(fù)菌株，通過western blot檢測野生菌與缺陷菌的各亞組分中磷壁酸合成的差異，鑒定SPD1672蛋白的酶活性位點(diǎn)，并分析其在不同菌株中對(duì)壁磷壁酸(WTA)與脂磷壁酸(LTA)合成的影響；采用PJWV25及PAE03質(zhì)粒熒光報(bào)告系統(tǒng)，對(duì)SPD1672蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；通過小鼠生存率的比較、體內(nèi)定植實(shí)驗(yàn)等的毒力實(shí)驗(yàn)分析spd1672基因?qū)?/p>

4、不同血清型肺炎鏈球菌毒力的影響。
　　結(jié)果：
　　通過western blot分析發(fā)現(xiàn)，D39菌株缺陷周質(zhì)環(huán)EL4后的磷壁酸合成減少，與缺陷spd1672基因后相一致，說明EL4是其關(guān)鍵功能域；進(jìn)一步的酶活性位點(diǎn)分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第206、270、287、306位氨基酸點(diǎn)突變后磷壁酸的合成量同野生菌相比幾乎沒有差異，而第304位組氨酸發(fā)生點(diǎn)突變后，其磷壁酸的合成量同缺陷spd1672基因后相一致，較野生菌顯著下降，提示該位點(diǎn)為S

5、PD1672蛋白的關(guān)鍵氨基酸；選擇抗磷酸膽堿抗體對(duì)野生菌及各點(diǎn)突變菌株進(jìn)行的磷酸膽堿含量分析顯示，各突變株的磷酸膽堿變化與磷壁酸含量的變化一致，進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論的可靠性。spd1672基因的N末端和C末端分別與GFP融合表達(dá)后，肺炎鏈球菌的邊緣發(fā)出熒光，提示該基因表達(dá)于細(xì)胞膜上。對(duì)3型菌株203和4型菌株TIGR4的磷壁酸合成檢測結(jié)果顯示，當(dāng)缺陷spd1672基因后，缺陷菌全菌組分及各亞組分磷壁酸的合成量都顯著減少，說明spd1672

6、基因在這兩種血清型菌株中也影響磷壁酸的合成；通過鼻腔的途徑感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D39△1672、203△1672、TIGR4△1672同野生菌相比，其在血、鼻咽部、肺及腦中的定植量較野生菌顯著減少，缺陷組的小鼠生存率顯著高于相應(yīng)的野生組的小鼠生存率。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果提示SPD1672蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，周質(zhì)環(huán)EL4是其重要的結(jié)構(gòu)功能域，第304位組氨酸是維持其聚合酶活性的關(guān)鍵氨基酸。spd1672基因?qū)?型、3型等血