Pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏中的作用及相關影響因子研究.pdf

1、本研究通過同源克隆在深綠木霉（Trichoderma atroviride）T23中獲得了在哺乳動物中研究甚多的與敵敵畏降解有關的基因pon，設計引物以T23 cDNA為模板擴增通過測序獲得了同源性最高的pon-6。用生物信息學軟件對PON-6蛋白結構進行了預測，并預測了PON-6與敵敵畏存在互作的Motif，PON-6與敵敵畏可以互作，軟件分析推測PON-6濃度是降解敵敵畏的關鍵因素之一。
　　因此，我們在木霉菌T23中分別構建

2、了pon-6基因的敲除載體和過表達載體，通過潮霉素篩選分別獲得了pon-6基因敲除子和過表達轉化子，southern blot鑒定為單拷貝，在CYA平板上形態(tài)學分析表明木霉菌pon-6基因敲除子，過表達轉化子與野生株T23形態(tài)上差別不明顯，但耐受敵敵畏的能力過表達轉化子明顯比野生株T23更強，敲除子最弱。通過研究敲除子和過表達轉化子降解敵敵畏的作用發(fā)現(xiàn)兩者均具有降解敵敵畏的作用，但降解效率過表達轉化子比野生株T23要高，敲除子最弱。RT

3、-PCR結果顯示pon-6基因隨著敵敵畏誘導時間的不同相對表達量有所不同，在同一時間轉化子中pon-6基因相對表達量高于野生株，但兩者pon-6基因相對表達量變化趨勢一致，均為在誘導6 h后達到最大，之后逐漸減弱。RT-qPCR的結果表明pon-6基因相對表達量與半定量結果趨勢基本一致。以上結果表明 pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏的過程中起了重要的作用。通過研究影響過表達轉化子降解敵敵畏的相關因素發(fā)現(xiàn)，其降解效率與葡萄糖劑量，初始敵敵

4、畏濃度及pH等因素有關，轉化子降解敵敵畏的葡萄糖最佳濃度為1000 ug/mL，最適pH值為8.0，初始濃度為500 ug/mL的敵敵畏時，木霉菌敵敵畏降解效率最高，敵敵畏初始濃度超過1000 ug/mL則會對木霉菌產生毒害而使其降解效率下降。
　　為了明確PON-6蛋白的亞細胞定位，通過構建eGFP與pon-6基因的融合表達載體，確定了PON-6蛋白位于木霉菌的胞內細胞質中，由于前期研究表明，木霉菌胞內敵敵畏降解效率高于胞外，因

5、此推斷敵敵畏可能通過某種機制進入胞內后由 PON-6蛋白降解，為下一步研究降解機理提供了重要線索。同時，本研究還通過GC-MS比較分析了木霉菌過表達轉化子與野生株T23降解敵敵畏的中間產物，發(fā)現(xiàn)兩者的代謝產物中均有二氯乙酸，且同一時間過表達轉化子中中間產物含量比野生型要高，這也進一步證明了pon-6基因在木霉菌降解敵敵畏中起了重要的作用。
　　為進一步研究pon-6基因與木霉菌中其它耐受或降解敵敵畏相關基因的關系，初步研究了pon

6、-6、cre1和hex1三者的相互關系，結果顯示，在cre1敲除子中pon-6基因的相對表達量沒有呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢，而是先低后高；pon-6基因在hex1敲除子中的相對表達量比在T23野生株和突變株中的相對表達量要低，而hex1基因在pon-6過表達轉化子中相對表達量最高，其次是野生株T23，敲除轉化子最低。以上結果表明木霉菌pon-6，cre1和hex1基因之間存在著關聯(lián)，即木霉菌降解敵敵畏，木霉菌生長代謝和木霉菌耐受敵敵畏之間