大鼠寡霉素敏感相關(guān)蛋白的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：心肌梗死已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的主要心血管疾病之一。心肌梗死早期心肌缺血預(yù)適應(yīng)主要通過改善心肌細(xì)胞的能量代謝對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。ATP合酶是細(xì)胞能量代謝中最重要的酶，寡霉素敏感相關(guān)蛋白(oligomycinsensitivity-conferringprotein，OSCP)作為ATP合酶上受到寡霉素調(diào)節(jié)的部位，直接參與能量代謝的調(diào)節(jié)。因此，通過對(duì)OSCP敏感部位基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控的研究可能為從調(diào)節(jié)能量代謝角度研究預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)

2、作用的機(jī)制提供新的方向。故本實(shí)驗(yàn)旨在通過克隆大鼠OSCP基因全長cDNA，并構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，為后續(xù)OSCP蛋白表達(dá)、活性鑒定及抗體制備等方面的研究工作奠定基礎(chǔ)。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)OSCP基因進(jìn)行了擴(kuò)增和克隆方面的研究，具體如下： 1.提取大鼠腦組織總RNA：采用一步法從新鮮大鼠腦組織中提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)量其在260nm和280nm波長的光密度，計(jì)算A260/A280比值確定

3、總RNA的純度：根據(jù)測(cè)定的A260值計(jì)算RNA的濃度；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。 2.RT-PCR：根據(jù)GeneBank中大鼠OSCP基因序列，采用國際通用的分子生物學(xué)軟件Primer5.0和Oligo4.01分別設(shè)計(jì)上、下游引物： 上游引物為：5'-AGGATCCATGGCCGCACCAGCAAC-3' 下游引物為：5'-AGTCGACTCAGAGCAGATCCCGCATG-3' 其中

4、上游引物中引入了限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別位點(diǎn)GGATCC，下游引物中引入了限制性內(nèi)切酶SalI的識(shí)別位點(diǎn)GTCGAC。引物的合成由上海生工生物公司完成，用于RT-PCR反應(yīng)。采用Oligo(dT)15為逆轉(zhuǎn)錄引物，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA。用PfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因OSCP，以增加擴(kuò)增基因的保真性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 3.重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定：

5、將PCR產(chǎn)物回收純化后，將其與克隆載體pTA2進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5a。擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，堿裂解法提取質(zhì)粒，用EcoRI進(jìn)行酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒。進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用GeneRunner、BLAST軟件進(jìn)行分析。 4.重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：重組質(zhì)粒pTA2-OSCP經(jīng)BamHI和SalI雙酶切后進(jìn)行純化，將回收的目的片段OSCP與經(jīng)同樣酶切和純化的原核表達(dá)載體pQE3

6、0-Xa片段用T4DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5α。擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒。進(jìn)行基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用GeneRunner、BLAST軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)對(duì)總RNA、RT-PCR產(chǎn)物、重組克隆載體和重組表達(dá)載體均進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定，如下： 1.總RNA的純度、濃度及完整性檢測(cè)：總RNA的OD260nm/

7、OD280nm為1.87，純度較好；RNA濃度為2989.8μg/ml；甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明所提總RNA完整性較好。 2.目的基因片段的RI-PCR擴(kuò)增：RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，在約700bp處出現(xiàn)一清晰的特異性條帶，與已發(fā)表的OSCP基因序列大小相同。 3.重組克隆載體的鑒定：重組質(zhì)粒pTA2-OSCP經(jīng)EcoRI單酶切鑒定，得到約3000bp的線性片段和約700bp的插入片段，結(jié)果與預(yù)期

8、設(shè)計(jì)大小相符；重組質(zhì)粒pTA2-OSCP經(jīng)PCR鑒定，得到約700bp的PCR產(chǎn)物，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)大小相符；選取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，顯示與已公布的大鼠OSCP基因序列同源性為100％。 4.重組表達(dá)載體的鑒定：pQE30-Xa-OSCP經(jīng)BamHI、SalI雙酶切鑒定，得到約為3500bp和約700bp的兩條線性片段，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)大小相符；pQE30-Xa-OSCP經(jīng)PCR鑒定，