磁富集多重PCR擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用.pdf

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),一直是生命科學(xué)領(lǐng)域一種重要的研究手段。增強(qiáng)其特異性,提高其靈敏度,是PCR技術(shù)研究的重點(diǎn)。
　　我們制備了平均粒徑為15 nm的γ-Fe2O3磁性納米粒子,并對(duì)其進(jìn)行鏈霉親和素修飾。實(shí)驗(yàn)證明鏈霉親和素修飾的γ-Fe2O3磁性納米粒子具有良好的生物活性,可以進(jìn)一步用于生物檢測(cè)。
　　我們將磁性納米粒子γ-Fe2

2、O3和多重PCR技術(shù)相結(jié)合,進(jìn)行了磁富集多重PCR擴(kuò)增,以增強(qiáng)其特異性,提高檢測(cè)靈敏度。
　　首先我們對(duì)該方法的可行性進(jìn)行分析,進(jìn)行了磁富集靶序列單重PCR擴(kuò)增。在這一實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,先將生物素修飾的特異性引物和靶序列雜交,然后通過(guò)鏈霉親和素修飾的磁性納米粒子γ-Fe2O3將其富集到表面,通過(guò)變性獲取單鏈靶序列,再使用目的序列的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,我們得到靶序列和特異性引物雜交的最適溫度為52.5℃,鏈霉親和

3、素修飾的磁性納米粒子γ-Fe2O3的最佳用量為90μg,該方法對(duì)靶序列檢測(cè)的靈敏度為5×10-10 ng/μL。確定了該方法的可行性。
　　然后我們?cè)O(shè)計(jì)了AGT基因M235T位點(diǎn)和A-6G位點(diǎn),MTHFR基因A1298C位點(diǎn)和C677T位點(diǎn)的擴(kuò)增引物,在磁富集單重PCR的基礎(chǔ)之上,對(duì)這四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磁富集多重 PCR擴(kuò)增,并優(yōu)化了擴(kuò)增條件。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)我們得到,這四個(gè)位點(diǎn)的磁富集多重 PCR的退火溫度為56℃,在30μL擴(kuò)增體系中,

4、25 mmol/L的Mg2+用量為2.0μL,10μmol/L的dNTP用量為1.5μL,5U/μL的Taq酶用量為0.7μL,10 mmol/L的四個(gè)位點(diǎn)引物的用量分別為:C677T1μL、M235T0.7μL、A1298C1μL、A-6G1.5μL。同時(shí)得到這四個(gè)位點(diǎn)的磁富集多重PCR擴(kuò)增的靈敏度為5×10-9 ng/μL。
　　最后,結(jié)合通用引物 PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù),對(duì)磁富集多重PCR擴(kuò)增方法在這四個(gè)位點(diǎn)的SNP分型上