應(yīng)用細(xì)胞芯片捕獲人腫瘤細(xì)胞并檢測(cè)其細(xì)胞表面CD抗原表型的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 腫瘤標(biāo)志物（tumormarker，TM），是指在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生或分泌并釋放到血液、體液中，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物可以分成以下幾大類(lèi)：①腫瘤胚胎性抗原；②酶和同工酶；③血漿蛋白；④細(xì)胞代謝產(chǎn)物；⑤腫瘤抗原；⑥癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物及微量元素。腫瘤抗原（tumorantigen）泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中新出現(xiàn)或者過(guò)度表達(dá)的一些抗原物質(zhì)。
　　 免疫應(yīng)答過(guò)程有賴(lài)于免

2、疫系統(tǒng)中細(xì)胞間的相互作用，一種是通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸，另一種是通過(guò)分泌細(xì)胞因子或其他活性分子而介導(dǎo)的相互作用。細(xì)胞表面功能分子是免疫細(xì)胞之間相互識(shí)別的物質(zhì)基礎(chǔ)，包括細(xì)胞表面的多種抗原、受體和其他分子。應(yīng)用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體所識(shí)別的同一分化抗原決定簇，統(tǒng)稱(chēng)為CD（clusterofdifferentiation）。一些研究者研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的CD抗原不同，并且CD與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密

3、不可分的聯(lián)系。
　　 本課題研究制備的細(xì)胞芯片就是用來(lái)高通量檢測(cè)細(xì)胞表面CD抗原的表達(dá)情況。將六十四種CD抗原單克隆抗體固定于載體上，首先形成抗體點(diǎn)陣，隨后利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，不同的單克隆抗體能夠自動(dòng)識(shí)別和捕獲表達(dá)相應(yīng)表面分化抗原的細(xì)胞，從而檢測(cè)多種腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)CD表型的表達(dá)情況。細(xì)胞芯片技術(shù)可快速地分析正常與癌細(xì)胞表面CD抗原表型的差異，不僅有助于腫瘤發(fā)病機(jī)制的闡明，還能篩選腫瘤細(xì)胞CD抗原表型標(biāo)志物，在腫瘤的

4、發(fā)生機(jī)制研究、診斷和治療方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 培養(yǎng)9種細(xì)胞備用，人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1、人胃腺癌細(xì)胞系7901、人正常肝上皮細(xì)胞系L-02、人肝癌細(xì)胞系Bel7404、人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人大腸癌細(xì)胞系HT29；
　　 2、應(yīng)用細(xì)胞芯片捕獲腫瘤細(xì)胞并檢測(cè)其細(xì)胞表面CD

5、抗原表型的表達(dá)；
　　 3、驗(yàn)證細(xì)胞芯片檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面CD抗原表型表達(dá)的特異性；
　　 （1）應(yīng)用RT-PCR（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）方法驗(yàn)證細(xì)胞芯片對(duì)人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1、人胃腺癌細(xì)胞系7901和人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞表面CD抗原表型的檢測(cè)結(jié)果；
　　 （2）基因測(cè)序驗(yàn)證人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1、人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞表

6、面CD抗原表型表達(dá)的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；
　　 （3）應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞芯片捕獲細(xì)胞的特異性；
　　 4、細(xì)胞芯片陽(yáng)性點(diǎn)熒光標(biāo)記CD的篩選。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞芯片上CD13、CD29、CD49e、CD55、CD44、CD71、CD95、CD133抗體點(diǎn)捕獲到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95抗體點(diǎn)捕獲

7、到人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞；CD29、CD44、CD49e、CD55、CD61、CD71、CD133、CD90抗體點(diǎn)捕獲到人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞；CD9、CD15、CD24、CD29、CD44、CD55、CD66、CD71抗體點(diǎn)捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞；CD13、CD29、CD44、CD55、CD71抗體點(diǎn)捕獲到人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞；CD9、CD13、CD15、CD29、CD49e、CD44、CD55、CD7

8、1、CD77抗體點(diǎn)捕獲到人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD56、CD57、CD71抗體點(diǎn)捕獲到人正常肝上皮細(xì)胞系L-02細(xì)胞；CD9、CD13、CD15、CD24、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點(diǎn)捕獲到人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95、CD77、CD133、CD1

9、03、CD64抗體點(diǎn)捕獲到人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞。
　　 2、RT-PCR檢測(cè)人胃腺癌細(xì)胞系7901和人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1CD表型mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD7、CD95的表達(dá)，與我們的細(xì)胞芯片檢測(cè)CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1CD表型mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達(dá)，與我們的細(xì)胞芯

10、片檢測(cè)CD表型的結(jié)果相一致。
　　 3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系7901與人胃正常細(xì)胞系GES-1細(xì)胞表面CD15、CD24、CD44的表達(dá)，流式結(jié)果顯示與我們的細(xì)胞芯片檢測(cè)CD表型的結(jié)果相一致。
　　 4、從FITC-CD14、FITC-CD4、PE-CD3、FITC-CD19、PE-Cy5一CD19、FITC-Cy5-CD2、FITC-CD3、Cy-Chrome-CD22和PE-CD14等9種熒光標(biāo)記的

11、CD中，篩選最佳細(xì)胞芯片陽(yáng)性標(biāo)點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE-CD13效果最好。
　　 結(jié)論：
　　 1、細(xì)胞芯片CD29、CD44、CD49、CD55、CD71、CD133抗體點(diǎn)均捕獲人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞；CD13、CD95抗體點(diǎn)捕獲到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞，未捕獲到人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞；CD9抗體點(diǎn)僅捕獲到人大細(xì)胞肺

12、癌細(xì)胞系H460細(xì)胞，未捕獲到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞；CD61、CD90抗體點(diǎn)僅捕獲到人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，未捕獲到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞。
　　 2、細(xì)胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點(diǎn)均捕獲到消化系腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞，人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞、人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)

13、胞；CD9抗體點(diǎn)捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞、人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞，未捕獲到人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞；CD13抗體點(diǎn)捕獲到人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞、人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞，未捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞；CD15抗體點(diǎn)捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞，未捕獲到人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞系7901

14、細(xì)胞；CD49e、CD77抗體點(diǎn)捕獲到人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞，未捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞和人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞；CD24、CD66、抗體點(diǎn)僅捕獲到人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞；CD95、CD133、CD103、CD64抗體點(diǎn)僅捕獲到人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞。
　　 3.、細(xì)胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點(diǎn)均捕獲到人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞、人大細(xì)胞肺癌細(xì)

15、胞系H460細(xì)胞、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞、人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞。
　　 4、細(xì)胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71抗體點(diǎn)捕獲到人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞和人正常肝上皮細(xì)胞系L-02細(xì)胞；CD15、CD77抗體點(diǎn)僅捕獲到人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞，未捕獲到人肝上皮細(xì)胞系L-02細(xì)胞；C

16、D56、CD57抗體點(diǎn)僅捕獲到人正常肝上皮細(xì)胞系L-02細(xì)胞，未捕獲到人肝癌細(xì)胞系Bel7404細(xì)胞。
　　 5、細(xì)胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點(diǎn)均捕獲到人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞；CD15、CD24抗體點(diǎn)僅捕獲到人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞，未捕獲到人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞；CD77、CD133、CD103、CD64抗體點(diǎn)僅捕獲

17、到人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞，未捕獲到人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞；CD15和CD24可能是人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD77、CD133、CD103、CD64可能是人胃癌細(xì)胞系7901細(xì)胞的標(biāo)志物。
　　 6、RT-PCR檢測(cè)人胃腺癌細(xì)胞系7901和人正常胃粘膜細(xì)胞系GES-1CD表型mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD7、CD

18、95mRNA的表達(dá)，與我們的細(xì)胞芯片檢測(cè)CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1CD表型mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達(dá)，與我們的細(xì)胞芯片檢測(cè)CD表型的結(jié)果相一致。
　　 7、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的方法，檢測(cè)人胃腺癌細(xì)胞系7901與人胃正常細(xì)胞系GES-1細(xì)胞表面表達(dá)CD15、CD24、CD44，結(jié)果顯示，人胃腺癌細(xì)胞系7901細(xì)胞表面不表達(dá)CD15、CD24，表達(dá)CD44；人胃正常細(xì)胞系GE