犬子宮蓄膿4種細(xì)菌多重PCR檢測方法的建立及溶菌酶抑菌效果觀察.pdf

1、犬子宮蓄膿是由于子宮內(nèi)膜增生并繼發(fā)化膿性感染而引發(fā)的子宮內(nèi)膜炎，又稱為犬囊性子宮內(nèi)膜炎—子宮積膿綜合征，即由內(nèi)分泌或激素受體的異常導(dǎo)致犬發(fā)生子宮內(nèi)膜囊性增生，在此基礎(chǔ)上有微生物介入并大量繁殖造成化膿性感染，是中老齡母犬常見的生殖系統(tǒng)疾病之一。細(xì)菌感染是本病發(fā)生的重要因素，人們已從患犬子宮中分離出多種細(xì)菌，包括鏈球菌（Streptococcus）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus

2、)和大腸桿菌（Escherichia coli）等，建立其多重PCR反應(yīng)快速檢測方法，對該病的分子生物學(xué)技術(shù)研究具有重要意義。
　　 本實驗根據(jù)鏈球菌EF-Tu(Elongation Factor Tu)基因、沙門氏菌invA(invasion proteinA)基因、金黃色葡萄球菌nuc(thermostable nuclease)基因和大腸桿菌phoA(Alkalinephosphatase)基因序列，設(shè)計并合成了4對引物，

3、通過特異性檢測，依次擴(kuò)增出了166bp、284bp、406bp和555bp大小的目的DNA片段。對該多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果得到最佳退火溫度為54℃，最佳引物濃度依次為100nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和60nmol/L，最佳Mg2+濃度為1.5mmol/L。同時對該反應(yīng)體系進(jìn)行了敏感性測定，結(jié)果4種細(xì)菌的DNA最低檢出限度依次為16.5pg/μl、3.11pg/μl、21.0pg/μl和3.52pg/

4、μl。通過對所收集的9份犬子宮蓄膿病料進(jìn)行多重PCR快速檢測，結(jié)果4種細(xì)菌的檢出率依次為88.9％、55.6％、11.1％和33.3％，混合感染占到了2/3。該多重PCR體系成功地從病料中檢測出了鏈球菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點，為今后人們在該病的微生物研究方面提供了新的思路，同時也為探討本病的細(xì)菌分布、發(fā)病規(guī)律等提供一定的數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　 本實驗通過建立溶菌酶抑菌培養(yǎng)基，來初步探討