SNL大鼠Th17細胞脊髓浸潤及其中樞敏化的可能機制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是指“來自外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變或功能紊亂所引起的疼痛”，臨床涉及范圍廣泛，感染、創(chuàng)傷、代謝性疾病、神經(jīng)受壓缺血、放化療等原因均可誘發(fā)，其特征表現(xiàn)為痛覺異常、痛覺過敏、甚至自發(fā)性疼痛。中樞敏化是目前解釋NP的主要理論，脊髓、丘腦、皮質水平均可發(fā)生中樞敏化，但關注最多的還是作為傷害性傳遞的第一中繼站脊髓水平。強烈的傷害性刺激可誘發(fā)活性依賴的中樞敏化，但在NP中，中樞敏化主要歸因于膠質

2、細胞的激活、周圍免疫細胞的浸潤和慢性神經(jīng)炎癥的形成。
　　 CD4+T細胞各亞群的平衡失調與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，包括NP。研究發(fā)現(xiàn)，損傷神經(jīng)局部浸潤的Th1、Th17細胞與NP的發(fā)展有關，Th2細胞作用相反；神經(jīng)損傷后，脊髓內亦發(fā)現(xiàn)有CD4+T細胞的浸潤，但其具體亞群及其功能目前并不清楚。CNS內浸潤的Th17細胞，是伴有NP疼痛特征的多發(fā)性硬化癥及實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)的主要病理損傷者，但其是否直接

3、介導了NP的形成，目前并不清楚。本項目通過體內外兩方面研究神經(jīng)損傷后，浸潤至脊髓內的CD4+T細胞的具體亞群，探索Th17細胞的中樞敏化作用及機制，為進一步了解中樞浸潤的免疫細胞在NP中的作用積累實驗數(shù)據(jù)。
　　 研究目的:
　　 (1)神經(jīng)損傷后，周圍CD4+T細胞遷移并浸潤至脊髓中樞，通過本研究的實施，旨在闡明浸潤至脊髓中樞的CD4+T細胞的具體亞群及其浸潤的分子機制。
　　 (2)小膠質細胞和星形膠質細胞在

4、NP中的作用已得到業(yè)界公認，前者與NP的產(chǎn)生有關，后者則在NP的維持中發(fā)揮重要作用。CD4+Th17細胞的中樞浸潤處于NP的維持階段，通過本項目的實施，探索浸潤至脊髓背角的Th17細胞與活化增殖的星形膠質細胞的相關性及其中樞敏化的可能機制。
　　 (3)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)是臨床上常見的NP疾患，繼發(fā)于帶狀皰疹病毒感染，且好發(fā)于細胞免疫功能降低的老年人，其發(fā)病似于機體的免疫功能改變密切相關。通過本研究，了解PHN患者周圍

5、免疫炎癥水平及其與PHN形成的相關性；并通過觀察抗中樞敏化治療療效，探索PHN的中樞機制，為PHN尋找免疫干預靶點。
　　 研究方法:
　　 (1)SNL大鼠模型的建立與鑒定
　　 成年雄性SD大鼠，沿L4-S1脊柱中線作-縱行切口，切除L6橫突及L6～S1關節(jié)突關節(jié)，游離L5、L6周圍組織，在其遠端緊結扎并切斷。假手術組除不結扎神經(jīng)外，其余均同手術組。
　　 根據(jù)實驗需要，分別于術后1、3、5、7、10

6、、14、21天用von Frey纖毛測定大鼠左足和(或)右足機械痛閾(Up and Down方法)，推算50％機械縮足閾值(50％MWT)，凡術后7天50％MWT>4.0 g，即認定建模失敗，排除在實驗之外。
　　 (2)FACS分析脊髓浸潤的CD4+T細胞
　　 暴露大鼠心臟，經(jīng)主動脈灌注NS后，收集L4-L6脊髓，制備單個細胞懸液，用percoll不連續(xù)密度梯度分離方法收集脊髓中的單個核細胞，將其重懸于100μL的P

7、BS體系中，分別加入FITC和PE標記的抗大鼠CD3、CD4抗體，4℃孵育30min，洗滌后多聚甲醛固定過夜，第二天上機檢測。
　　 (3)分析脊髓背角浸潤的Th17細胞
　　 依次用NS和4％多聚甲醛灌注心臟，游離L5-L6脊髓，經(jīng)4％多聚甲醛固定、30％蔗糖沉底、OCT介質包埋后，制備14μm冰凍切片，免疫熒光檢測Th17細胞。另取新鮮的左側L4-L6脊髓背角組織，RT-qPCR檢測脊髓中促炎因子IL-17 mRNA

8、、轉錄因子RORγt mRNA、趨化因子CCL2、CCL20、CXCL10 mRNA的表達情況。ELISA檢測血清中IL-17、IFNγ、IL-4的含量。根據(jù)上述結果分析Th17細胞脊髓浸潤及其分子機制。
　　 (4)Th17細胞中樞敏化機制研究
　　 免疫熒光分析左側L5-6脊髓GFAP的表達情況，RT-qPCR檢測L5-6脊髓背角促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6 mRNA的含量；體外用不同濃度的IL-17刺激培

9、養(yǎng)的星形膠質細胞，MTT測定星形膠質細胞的增殖情況，RT-qPCR檢測星形膠質細胞促炎因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA的表達。結合兩者的研究結果，分析Th17細胞中樞敏化機制。
　　 (5)PHN患者免疫疼痛機制及中樞干預研究
　　 采集PHN患者外周血，F(xiàn)ACS分析T淋巴細胞亞群；ELISA檢測血清中IL-12、IL-17、IFNγ、IL-4、IL-15、IL-1α的含量。硬膜外注射抗炎藥物得寶松聯(lián)合或不聯(lián)合

10、鞘內注射抗傷害性傳導藥物咪達唑侖進行中樞干預，評估鎮(zhèn)痛效果及不良反應。
　　 結果:
　　 (1)20只用于模型制備及鑒定的大鼠，除實驗初期有2只誤被結扎L4神經(jīng)外，余18只中僅有2只術后7天50％MWT>4.0 g。脊神經(jīng)結扎組手術側足可見五趾并攏內收、輕度外翻、站立姿勢異常及自發(fā)痛形成。L5、L6脊神經(jīng)結扎后3天，手術側足50％MWT為(4.76±4.0)g，顯著低于假手術組及對照組(P<0.001)；至術后7天，5

11、0％MWT下降至(1.91±0.98)g(P<0.001)，術后21天達最低值(1.16±0.68)g(P<0.001)；右足則在術后10～14天出現(xiàn)“鏡像痛”。
　　 (2)脊神經(jīng)結扎后7天，腰段脊髓CD4+T細胞浸潤明顯增加，占單個核細胞的10.08％(P<0.001)；浸潤的CD4+T細胞為Th17細胞，主要位于脊髓背角淺層，伴有脊髓背角高表達mRNA IL-17(P<0.05)、RORγt(P<0.05，P<0.01)、

12、CCL2(P<0.01)、CCL20(P<0.05)，CXCL10 mRNA的表達未見明顯改變。術后7、14天，脊神經(jīng)結扎組血清IL-17、IFNγ、IL-4的含量與對照組及假手術組相比，未見明顯增加。
　　 (3)脊神經(jīng)結扎后7天，脊髓背角淺層GFAP表達增加，脊髓背角促炎因子IL-1β、IL-6 mRNA上調(P<0.01，P<0.05)；IL-6與IL-1β相比，其高表達的持續(xù)時間更長，至術后14天仍顯著高于對照組及假手術

13、組(P<0.05)；術后7天、14天，TNF-αmRNA在三組間無顯著差異(P>0.05)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，100ng/mL IL-17刺激星形膠質細胞3天，即可促進其顯著增殖，并上調促炎因子的表達。
　　 (4)PHN組周圍CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞含量分別為(61.13±9.702)％、(34.2±5.388)％、(26.93±6.273)％，正常對照組分別為(66.73±6.584)％、(37.53±4.37

14、3)％、(29.2±6.002)％，PHN組雖有所下降，但并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。PHN組血清IL-17、IFNγ、IL-4、IL-12、IL-15、IL-1α的含量亦未見明顯改變(P>0.05)。與基礎值相比，兩種不同方法的抗中樞敏化治療均顯著降低自覺疼痛與觸誘發(fā)痛的VAS評分(P<0.001)，得寶松聯(lián)合咪達唑侖的中樞干預措施獲得了更優(yōu)的鎮(zhèn)痛效果，尤其在治療后的6～8W內。
　　 結論:
　　 (1)結扎大鼠

15、一側的L5、L6神經(jīng)，可以成功制備神經(jīng)病理性疼痛SNL模型。該模型制備的成功率高、重復性好、機械痛敏出現(xiàn)早且痛閾下降顯著，可較好地模擬PHN患者的灼性神經(jīng)痛。一側脊神經(jīng)結扎可致對側足出現(xiàn)“鏡像痛”現(xiàn)象。
　　 (2)脊神經(jīng)結扎后，脊髓浸潤的CD4+T細胞主要為Th17細胞，其浸潤可能與脊髓背角高表達的趨化因子CCL2、CCL20相關。
　　 (3)根據(jù)體內外研究結果，首次提出Th17細胞參與中樞敏化的可能機制，即通過其產(chǎn)

16、生的IL-17作用于星形膠質細胞上的IL-17R，在促進其活化增殖的基礎上，使傷害性神經(jīng)元信號得以其為媒介得到迅速擴展和維持；另一方面IL-17通過上調星形膠質細胞促炎因子的分泌，直接或間接增加了傷害性神經(jīng)元的興奮毒性，也導致NP的維持。此作用機制也說明了為什么短暫的Th17細胞浸潤對NP會產(chǎn)生長期的影響。
　　 (4)PHN盡管繼發(fā)于帶狀皰疹病毒感染，好發(fā)于老年人，但從我們的研究結果來看，PHN患者周圍機體的免疫炎癥狀態(tài)與健康