人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力的標(biāo)準(zhǔn)化與量化研究.pdf

1、第一部分標(biāo)準(zhǔn)化的無血清培養(yǎng)對(duì)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的影響
　　臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mensenchymal StemCell, hUC-MSCs)具有更強(qiáng)更穩(wěn)定的增殖分化能力，來源方便充足，對(duì)供者無傷害，病原微生物感染率低，安全性高。hUC-MSCs具有較高的免疫調(diào)控能力，是臨床治療血液疾病安全性高的異體干細(xì)胞。目前，傳統(tǒng)的MSCs培養(yǎng)體系中含有一定比例的動(dòng)物血清(Serum

2、 Containing Medium)成分，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用造成安全隱患。
　　本研究對(duì)比無血清與有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs增殖、衰老、細(xì)胞表面及全能標(biāo)志物、多向分化潛能，重點(diǎn)關(guān)注了兩個(gè)培養(yǎng)體系在免疫抑制方面的不同，探索培養(yǎng)hUC-MSCs的標(biāo)準(zhǔn)化方法，達(dá)到臨床的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。
　　目的:驗(yàn)證不同個(gè)體臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的安全性以及免疫調(diào)節(jié)作用，安全的應(yīng)用于臨床治療。
　　方法:(1

3、)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外長(zhǎng)期傳代以及衰老情況，測(cè)定生長(zhǎng)曲線;長(zhǎng)期傳代至終末期，采用Cellular Sencence Assay Kit檢測(cè)衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶的活性;(2)流式檢測(cè)hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其細(xì)胞表面分子標(biāo)志以及全能標(biāo)志物的檢測(cè);(3)對(duì)比hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)其多向分化能力情況;(4)通過健康成人外周血激活期和靜止期的NK細(xì)胞分別與不同個(gè)體不

4、同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs共培養(yǎng)，流式檢測(cè)IFN-γ陽性的NK細(xì)胞的百分比，評(píng)價(jià)對(duì)固有免疫的調(diào)節(jié)作用;(5)通過BrdU酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)比兩個(gè)培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs對(duì)PBMC增值的抑制能力;(6)比較hUC-MSCs在有血清與無血清培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)后免疫抑制能力，通過不同個(gè)體不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，利用免疫酶聯(lián)試劑盒檢測(cè)上清中IFN-γ的分泌水平，檢測(cè)上清中PGE2、IDO、IL

5、-6的分泌，Real-time PCR檢測(cè)免疫相關(guān)因子TNF-beta、IL-10、IL-27、Galectin-1、Galectin-3、IDO1、COX2、 HGF及IL-6等mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs呈典型的長(zhǎng)梭形貼壁細(xì)胞，與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs相比生長(zhǎng)曲線較平緩，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)較晚，較早出現(xiàn)β半乳糖苷酶的活性;(2)無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均高表達(dá)CD29，CD44

6、，CD73，CD90，CD105及CD106等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記，不表達(dá)CD34，CD45，CD11b，CD19，HLA-DR，但是無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs全能標(biāo)志物Nanog，SOX2，Oct4，SSEA-4的陽性率更高;(3)無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs與有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有成脂成骨成軟骨分化能力;(4)兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs分別與激活期靜止期的NK細(xì)胞共培養(yǎng)16h后，流式檢測(cè)分泌IFN-γ

7、的NK細(xì)胞百分比均明顯減少，兩者沒有明顯差異，均對(duì)靜止期NK細(xì)胞的抑制能力更強(qiáng);(5)無血清和有血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的hUC-MSCs均抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖，均明顯抑制單個(gè)核細(xì)胞的IFN-γ分泌，兩者PGE2、IDO、IL-6的分泌均沒有差異，無血清培養(yǎng)體系分泌的HGF明顯高于有血清培養(yǎng)體系;(6) mRNA水平上無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的免疫相關(guān)因子TGF-beta1、IL-6、HGF高于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的，

8、但Galectin-1表達(dá)水平低于有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs表達(dá)的。
　　結(jié)論:(1)與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)體系相比較，無血清培養(yǎng)體系體外增殖速度較慢、較早出現(xiàn)衰老;(2)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs在細(xì)胞表面以及多向分化等生物學(xué)特性相似，無血清培養(yǎng)的hUC-MSCs具有更原始的狀態(tài);(3)無血清培養(yǎng)和有血清培養(yǎng)的hUC-MSCs均具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，且沒有差異性。
　　第二部分:定量評(píng)估不同個(gè)體人臍帶間充質(zhì)干

9、細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種組織系統(tǒng)的細(xì)胞。此外，在造血、免疫、炎癥反應(yīng)、血管新生等人體重要功能中起調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)在更多關(guān)注MSCs的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-M

10、SCs）分離自臍帶，涉及倫理問題較少相對(duì)更原始。MSC免疫抑制能力的最好例子是同種異體的MSC能有效治療重度移植物抗宿主病。體外研究表明，MSC能夠抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前對(duì)MSC免疫調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全清楚，但是越來越多研究表明其主要通過細(xì)胞間接觸如PD1-PD-L1，及可溶性因子如前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)、半乳糖凝集

11、素-1(Galectin-1，Gal-1)、半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowth factor-beta，TGF-β)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)等發(fā)揮免疫抑制功能。hUC-MSC治療自身免疫系統(tǒng)疾病、移植物抗宿主病已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)研究階段進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)hUC-MSC有很好的應(yīng)用前景，但不同個(gè)體臍帶來源

12、間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性差別很大，目前缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法篩選出強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力的理想細(xì)胞。
　　目的:驗(yàn)證不同個(gè)體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力具有穩(wěn)定的差異性，以人外周血單個(gè)核共培養(yǎng)體系作為檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)效力的方法不穩(wěn)定因素太多，所以我們需探尋定量檢測(cè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性的方法，為臨床治療打下基礎(chǔ)。
　　方法:(1)不同個(gè)體hUC-MSC和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外共培養(yǎng)，免疫酶聯(lián)試劑盒檢測(cè)上清IFN-γ的分泌水平，反應(yīng)人臍

13、帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)活化后的外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫抑制能力;(2)外源性炎癥因子刺激不同個(gè)體hUC-MSC在mRNA水平上免疫相關(guān)因子的表達(dá);（3)外源性炎癥因子刺激不同個(gè)體hUC-MSC，培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞PGE2、IDO、Galectin-I、Galectin-3、TGF-beta1、HGF的分泌，驗(yàn)證蛋白分泌與免疫抑制能力的相關(guān)性;(4)吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)特異性抑制劑1-M-Trp、前列

14、腺素E2(PGE2)合成抑制劑NS-398預(yù)處理，分別阻斷hUC-MSCs分泌PGE2、IDO，和健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)阻斷蛋白分泌后對(duì)hUC-MSCs免疫抑制效應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:(1)不同個(gè)體hUC-MSCs對(duì)IFN-γ分泌的抑制能力有顯著性差異性穩(wěn)定存在，對(duì)IFN-γ分泌的抑制率可反映個(gè)體hUC-MSC的免疫抑制能力;(2)炎癥因子刺激后IDO1、COX2、 TGF-beta1、Galectin-1、HGF、

15、IL-6、Galectin-3等免疫相關(guān)因子mRNA明顯升高，IL-10、IL-27未見明顯變化。(3)比較不同個(gè)體hUC-MSC刺激后的因子分泌量與其抑制IFN分泌的抑制率的相關(guān)性，得出結(jié)論P(yáng)GE2具最高的相關(guān)性，IDO、IL-6次之。(4)阻斷IDO未逆轉(zhuǎn)hUC-MSC對(duì)于活化單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ抑制作用，但阻斷PGE2后，hUC-MSC對(duì)活化單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ抑制作用顯著降低，盡管未完全逆轉(zhuǎn)，但說明了PGE2的關(guān)鍵性作用。