氯化鋰介導(dǎo)Wnt-β-catenin信號(hào)對(duì)經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和分化潛能的細(xì)胞群體,由于其獨(dú)特的生物學(xué)特征和功能,已成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展迅速且廣受關(guān)注的領(lǐng)域,干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用潛力也日益得到重視。然而,目前制約干細(xì)胞推廣應(yīng)用的瓶頸問題是如何獲得適合臨床應(yīng)用的干細(xì)胞來源和充足的細(xì)胞量,如何能夠定向誘導(dǎo)分化。
　　 近年來國(guó)外學(xué)者從女性經(jīng)血中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞(menstrual blood-derivedmesenchymal stem cells,MMC

2、s),不僅克服了胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESC)來源和倫理之爭(zhēng),也緩解了骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)經(jīng)創(chuàng)傷途徑獲取和細(xì)胞數(shù)量有限的局限性。這種新型干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞的基本表面標(biāo)志物,免疫源性低,具有自我更新和多向分化潛能,體外采用特定的誘導(dǎo)劑處理后可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來希望。然而,國(guó)內(nèi)未見相關(guān)研究報(bào)道。
　　 干細(xì)胞發(fā)育受多條信號(hào)

3、通路的共同參與,其中Wnt／β-catenin信號(hào)通路通過影響下游靶基因的表達(dá)變化調(diào)控干細(xì)胞的增殖與分化。有研究報(bào)道胚胎干細(xì)胞、骨髓、臍血問充質(zhì)干細(xì)胞中Wnt／β-catenin信號(hào)的存在,可以通過添加外源性Wnt蛋白啟動(dòng)或通過抑制GSK-3β、APC等信號(hào)通路成分的活性間接激活Wnt信號(hào),而在國(guó)內(nèi)外此信號(hào)通路如何調(diào)控MMCs的生物學(xué)行為均未見相關(guān)報(bào)道。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),臨床常規(guī)治療躁狂或抑郁癥等精神性疾病的藥物鋰鹽能夠刺

4、激干細(xì)胞增殖,當(dāng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加氯化鋰時(shí),能抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中GSK-3β的激酶活性,阻礙GSK-3β介導(dǎo)的β-catenin磷酸化,導(dǎo)致β-catenin的核內(nèi)積累,進(jìn)而激活Wnt／β-catenin信號(hào)通路。因此,氯化鋰是GSK-3β的抑制劑。
　　 本實(shí)驗(yàn)在成功分離、培養(yǎng)MMCs的基礎(chǔ)上,采用氯化鋰作用于增殖和誘導(dǎo)分化后的MMCs,RT-PCR和western blot分別檢測(cè)MMCs中β-catenin的表達(dá)量,

5、探索氯化鋰是否通過介導(dǎo)Wnt／β-catenin信號(hào)通路調(diào)控MMCs的增殖和分化。
　　 本論文共分為三部分,第一部分:MMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；第二部分:體外誘導(dǎo)MMCs神經(jīng)元樣細(xì)胞分化；第三部分:氯化鋰對(duì)MMCs中Wnt／β-catenin信號(hào)通路成員β-catenin的影響。
　　 第一部分:本課題所用經(jīng)血均為健康女性志愿者提供。采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液,密度梯度離心法收集經(jīng)血單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng),多次換液棄

6、去懸浮生長(zhǎng)的血細(xì)胞,利用間充質(zhì)干細(xì)胞較單核細(xì)胞易脫落的特點(diǎn),傳代純化擴(kuò)增細(xì)胞；采用CCK-8法測(cè)定并繪制細(xì)胞增殖曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MMCs表面分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)血中存在問充質(zhì)干細(xì)胞,且能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)；細(xì)胞增殖活力強(qiáng),P10代與P3代MMCs的增殖速率沒有較大改變；MMCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記如CD29、CD44,不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34和泛白細(xì)胞標(biāo)記物CD45,HLA-ABC低表達(dá),幾乎不表達(dá)HLA-DR,說明免疫源

7、性較低；
　　 第二部分:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MMCs中是否存在神經(jīng)前體細(xì)胞；采用bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h,β-巰基乙醇和DMSO聯(lián)合誘導(dǎo)MMCs10h向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。用RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA的表達(dá)情況,并采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定誘導(dǎo)后MMCs是否表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)志基因NSE、NF。結(jié)果表明誘導(dǎo)前MMCs出現(xiàn)Ne

8、stin陽(yáng)性染色,證實(shí)MMCs中有神經(jīng)前體細(xì)胞的存在。誘導(dǎo)后MMCs能特異性表達(dá)NSE、NF,不表達(dá)GFAP,證明誘導(dǎo)后的細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞,而不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。NF、NSE mRNA表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),可能與神經(jīng)元分化的進(jìn)行有關(guān)。
　　 第三部分:在DMEM高糖培養(yǎng)基中分別加入不同濃度(2,4,8,10,20,40mmol／L)的氯化鋰,并持續(xù)處理MMCs4d,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察:CCK-8法檢測(cè)MMCs增殖情況；RT-

9、PCR、western blot分別檢測(cè)氯化鋰處理前后MMCs中β-catenin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化；另在神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中4 mmol／L氯化鋰處理MMCs4d,以檢測(cè)MMCs分化后β-catenin基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4d的培養(yǎng)條件下,低濃度氯化鋰(4 mmol／L)促進(jìn)MMCs增殖,高濃度氯化鋰(10 mmol／L以上)反而抑制MMCs增殖,表明氯化鋰能激活Wnt／β-catenin信號(hào)通路,卻存在劑量依賴性。4