skMLCK及CaM在LPS誘導(dǎo)的ARDS導(dǎo)致膈肌收縮力下降中的作用.pdf

1、目的:通過腹腔內(nèi)注射LPS(Lipopolysaccharide)構(gòu)建大鼠急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome ARDS)動物模型，采用實時定量熒光聚合式酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)的實驗方法檢測ARDS導(dǎo)致大鼠膈肌收縮力下降中骨骼肌肌球蛋白輕鏈激酶(skeletal muscle light chain kinase skMLCK)及鈣調(diào)蛋白(calmodulin CaM

2、)mRNA的表達水平的變化及其是否與誘導(dǎo)時間有關(guān)。同時將skMLCK mRNA及CaM mRNA的表達水平與前期工作基礎(chǔ)測得的膈肌收縮力進行相關(guān)性分析，初步研究skMLCK及CaM mRNA表達水平的變化是否在LPS誘導(dǎo)ARDS導(dǎo)致膈肌收縮力下降中的發(fā)揮作用，并進一步探討ARDS導(dǎo)致呼吸衰竭膈肌收縮力下降的分子機制。
　　方法:將32只健康且月齡在2月±1周的雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠(250±20)g隨機分為對

3、照組及實驗組，每組大鼠均為8只(n=8)。其中對照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水(10ml/day)，實驗組大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射LPS(8mg/kg/day)并將實驗組隨機分為24h組、48h組及7d組。其中，LPS24h組在腹腔內(nèi)注射LPS后觀察24h;LPS48h組腹腔注射LPS，24h后再次向大鼠腹腔注射LPS共觀察48h;7d組腹腔注射LPS后觀察24h后再腹腔注射LPS共觀察7天。在構(gòu)建ARDS動物模型期間分別觀察各組大鼠的行為表現(xiàn)及一

4、般狀態(tài)（呼吸、血壓等）等情況并記錄。所有組別大鼠待觀察實驗點結(jié)束后于10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔麻醉后，抽取各組大鼠頸動脈血測定血氣并計算氧合指數(shù)。迅速取出各組大鼠膈肌組織并將其剪成60mg左右大小膈肌條置于EP管中，并置于-80℃冰箱保存。待膈肌取出后，用加入肝素的生理鹽水經(jīng)右心室注入肺動脈內(nèi)對肺血管床進行沖洗，最終取出各組大鼠肺組織，每只大鼠均取出右肺上葉測量干濕重并計算濕/干重比，留取剩余肺組織部分于-80℃保存，部分于

5、組織固定液中固定。最終應(yīng)用蘇木精及伊紅（hematoxylin and eosin HE）染色在光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理形態(tài)，通過實時熒光定量聚合式酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)實驗技術(shù)方法分別測定各組大鼠膈肌組織skMLCK及CaM mRNA表達水平并與對照組進行比對，最終通過統(tǒng)計學(xué)軟件運用相應(yīng)統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及分析。
　　結(jié)果:1. ARDS動物模型:
　　1.1.大鼠行為學(xué)表現(xiàn):
　　1.1.

6、1.對照組大鼠一般狀態(tài)良好，飲食、飲水正常，毛發(fā)發(fā)育正常，活動力強，呼吸及血壓平穩(wěn)。
　　1.1.2 LPS各實驗組的大鼠腹腔注射LPS后均出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)無光澤、反應(yīng)遲鈍、厭食、厭水、畏寒、呼吸急促及血壓降低等表現(xiàn)。
　　1.1.2.1.呼吸頻率:LPS各實驗組大鼠呼吸頻率明顯比對照組增快且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;LPS各實驗亞組之間呼吸頻率差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　1.1.2.2.平

7、均動脈壓(MAP):LPS各實驗組大鼠平均動脈壓明顯比對照組降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);LPS各實驗亞組之間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　1.2.氧合指數(shù)(PO2/FiO2):LPS各實驗組大鼠氧合指數(shù)明顯比對照組降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);LPS各實驗亞組之間氧合指數(shù)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　1.3肺損傷評分:LPS各實驗組肺組織損傷評分較對照組明顯升高且差異具有

8、明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);LPS各實驗亞組之間肺損傷評分比較差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，48h肺損傷評分最高，表明在48h可能對肺組織的損傷最重，7d組肺損傷評分較24h低，表明在7d時可能出現(xiàn)逐漸恢復(fù)的過程。
　　1.4膈肌收縮功能:
　　1.4.1.等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA):LPS各實驗組與對照組比較，LPS各實驗組(Pt/CSA)下降且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

9、r>　　1.4.2.最大強直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA):LPS各實驗組與對照組比較，LPS各實驗組(P0/CSA)下降且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、膈肌skMLCK mRNA表達:LPS各實驗組膈肌skMLCK mRNA表達均比對照組低且差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LPS各亞組間(LPS24h、LPS48h、LPS7d組)膈肌skMLCK mRNA表達差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)

10、，即與LPS誘導(dǎo)時間無關(guān)。
　　3、 skMLCK mRNA的表達及膈肌收縮力進行相關(guān)性分析。將skMLCK mRNA表達與等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積（Pt/CSA）進行相關(guān)性分析，得出膈肌skMLCK mRNA的低表達與膈肌等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.53 P＜0.05);將膈肌skMLCK mRNA的表達與最大強直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)進行相關(guān)性分析，得出膈肌skMLC

11、K mRNA的低表達與最大強直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.57 P＜0.05)。
　　4、 CaM mRNA的表達:與對照組相比，LPS各實驗組膈肌CaM mRNA的表達均比對照組高，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，各實驗組之間(LPS24h、LPS48h、LPS7d組)膈肌CaM mRNA表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），即與LPS誘導(dǎo)時間無關(guān)。
　　5、 CaM mRNA的表

12、達及膈肌收縮力進行相關(guān)性分析。通過統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS22.0對CaM mRNA的表達及膈肌收縮力進行相關(guān)性分析。將CaM mRNA的表達與等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/CSA)進行相關(guān)性分析，得出膈肌CaMmRNA的高表達與膈肌等張收縮力標(biāo)準(zhǔn)化/膈肌橫截面積(Pt/C SA)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.41 P＜0.05）。將膈肌CaM mRNA的高表達與最大強直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)進行相關(guān)性分析，得出膈肌CaM m

13、RNA的高表達與最大強直收縮力/膈肌橫截面積(P0/CSA)兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.43 P＜0.05)。
　　6、 skMLCK mRNA與CaM mRNA表達的相關(guān)性
　　通過對膈肌CaM及skMLCK mRNA表達進行相關(guān)性分析結(jié)果提示:膈肌CaM mRNA的高表達與skMLCK mRNA的低表達呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.49 P＜0.05)。
　　結(jié)論:skMLCK mRNA的低表達及CaM mRNA的高表達