程序化冷凍和玻璃化冷凍技術實用性的對比研究.pdf

1、1978年，世界第一例試管嬰兒Louis Brown誕生的消息傳來，世界各國的人們集聚無比興奮的心情與追逐先進的欲望，紛紛開始開展這項技術。隨著輔助生育技術(assisted reproductive technology，ART)的發(fā)展，胚胎冷凍技術已經成為其發(fā)展不可分割的一部分。盡管人類的胚胎低溫保存已然成為人類輔助生殖中公認的技術，然而植入前胚胎在哪一個階段實施低溫冷凍儲藏的效果最佳尚未明了。程序化慢速冷凍法是一項較成熟的冷凍技術

2、，廣泛的應用于輔助生殖領域，而目前玻璃化冷凍作為一種新的冷凍保存方法，與傳統的程序慢速冷凍相比顯得更加簡單快速有效，其在復蘇率、囊胚形成率、囊胚孵出率等方面都具有一定的優(yōu)勢。而且玻璃化冷凍技術應用的同時還減少了實驗室的工作量、降低了成本，最大限度的提高了每次促排卵/取卵周期可供嘗試的妊娠次數，顯示出了更強的實用性。
　　目的：本實驗以小鼠4細胞、8細胞及囊胚胚胎作為實驗對象，以Cryoloop為載體，分別進行兩種不同的冷凍方式，探

3、討和對比兩種冷凍方法對于不同時期的小鼠胚胎冷凍效果。
　　方法：
　　1昆明小鼠常規(guī)促排卵，體外受精，分別于 HCG后48~50小時、60~62小時和85~96小時取4細胞、8細胞和3至4期囊胚進行程序化和玻璃化冷凍。
　　2玻璃化冷凍與復蘇：胚胎首先用預平衡液7.5％(v/v) EG、7.5%(v/v)DMSO平衡2分鐘；然后轉入15%(v/v) EG、15%(v/v) DMSO、0.65M sucrose的玻璃化冷

4、凍液中，時間控制在30秒內。胚胎復蘇采用0.33M、0.2M、0M sucrose復蘇液，梯度稀釋逐步洗脫冷凍保護劑,平衡時間分別為2min、3min和5min。
　　3程序化冷凍與復蘇：胚胎在冷凍液中處理后裝入麥管，置入冷凍儀，起始溫度20℃，以-2℃/min的速度降至-7℃，在-7℃保持5分鐘，人工植冰，保持10分鐘。以-0.3℃/min的速度降至-35℃，以-50℃/min的速度降至-150℃，從程序降溫儀中取出麥管放入液氮

5、中，在液氮內將麥管轉入麥管盒中，放入胚胎保存液氮。
　　結果：
　　1.四細胞組程序化冷凍了104枚胚胎，解凍后存活97，存活率93.2%（97/104），繼續(xù)培養(yǎng)到72小時后，囊胚形成率為84.5%(82/97),囊胚孵出率65.9%（54/82）。玻璃化冷凍了118枚胚胎，解凍后存活109枚，存活率92.3%（109/118），胚胎繼續(xù)培養(yǎng)到72小時后，囊胚形成率為84.5(82/97)，囊胚孵出率65.9%（54/82

6、）。兩組4細胞胚胎在存活率，囊胚形成率，囊胚孵出率的差別沒有統計學意義（P＞0.05）
　　2.八細胞組程序化冷凍了110枚胚胎解凍后存活90枚，存活率81.8%，培養(yǎng)至72小時后，囊胚形成率為84.4%（76/90），囊胚孵出率為76.3%(58/76)。玻璃化冷凍了112枚胚胎，解凍后存活102枚，存活率91.1%，胚胎培養(yǎng)到72小時后，囊胚形成率為93.2%（97/112），囊胚孵出率為88.7%（86/97）。兩組8細胞胚

7、胎在存活率，囊胚形成率，囊胚孵出率的差別有統計學意義
　　囊胚組程序化冷凍了101枚胚胎，解凍后存活83枚，存活率82.2%(83/101)，凍融后囊胚孵出率為61.4%（51/83）。玻璃化冷凍了92枚胚胎，解凍后存活85枚，存活率92.4%。凍融后囊胚孵出率為82.4%（70/85）。兩組囊胚分別進行玻璃化冷凍與程序化冷凍并解凍后在存活率，囊胚孵出率的差別有統計學意義
　　結論：
　　玻璃化冷凍技術比程序化冷凍技術