糖胺聚糖在膿毒癥中內(nèi)皮糖萼保護作用的研究.pdf

1、膿毒癥又稱全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是重癥監(jiān)護室中位居第一的致死病癥。膿毒癥發(fā)病原因多為嚴重創(chuàng)傷、燒傷、器官移植或大手術之后帶來的細菌、真菌、支原體、病毒等病原微生物所引起的感染，并進一步發(fā)展成為系統(tǒng)性炎癥反應、免疫失控和凝血功能障礙。炎癥反應、免疫失控和凝血功能障礙三者相互作用又可導致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunc

2、tion syndrome，MODS)，最終導致患者死亡。近年來，膿毒癥發(fā)病有逐年上升趨勢，全球每年大約新增一千九百萬例膿毒癥患者。膿毒癥的死亡率超過四分之一。膿毒癥發(fā)病率高且發(fā)病機制復雜，其發(fā)病迅速，病程進展快，目前無有效的治療手段，膿毒癥和膿毒性休克已成為重癥醫(yī)學面臨的首要難題。
　　膿毒癥中內(nèi)皮細胞糖萼的破壞是病理進程中的重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮糖萼的結構被破壞之后，其功能缺失。首先，血管內(nèi)皮糖萼的屏障功能削弱或喪失，隱藏在其中的

3、多種信號分子和酶也同時喪失;其次，血管內(nèi)皮糖萼對內(nèi)皮細胞的保護作用遭到破壞，糖萼的機械應力轉導功能被削弱。之后，一系列病理改變出現(xiàn)，包括血管通透性增加，水腫的發(fā)生，內(nèi)皮細胞與白細胞的粘附，凝血系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡與血管緊張度降低等。
　　肝素(Heparin，HP)和低分子肝素應用于膿毒癥的治療已有多年臨床實踐經(jīng)驗，主要是發(fā)揮抗凝作用。鑒于糖胺聚糖是內(nèi)皮糖萼的主要成分，膿毒癥時外源糖胺聚糖對膿毒癥時損傷糖萼的保護作用尚無系統(tǒng)的研

4、究。本課題擬考察肝素及其衍生物以及舒洛地特(Sulodexide，SLX)對膿毒癥中糖萼破壞因素以及糖萼破壞情況的影響，及其對心臟、小腸和腦部糖萼損傷的保護作用，以闡明糖胺聚糖類藥物在膿毒癥中的治療作用及其機制。主要研究內(nèi)容包括:
　　1.建立小鼠膿毒癥生存率模型，考察HP及其衍生物(包括SST0001，M402，ROH)，乙酰肝素，SLX對小鼠膿毒癥28天生存率的影響。其中ROH，HP，SLX可顯著提高膿毒癥小鼠的生存率。選擇這

5、三者開展后續(xù)研究。
　　2.建立小鼠膿毒癥模型，用ELISA法檢測HP、ROH和SLX對膿毒癥小鼠血清HPA和MMP-9這兩個糖萼破壞因素、HS和Syndecan-1這兩種糖萼脫落標志物的含量及其時相變化的影響。
　　2.1 膿毒癥時小鼠血清HPA含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥模型組小鼠HPA血清含量在造模后3～12h與對照組相比顯著下降(P＜0.05)，且3h～12h時間段內(nèi)小鼠HPA血清含量持續(xù)下降

6、(P＜0.05)。HP組在造模后3h，9h，12h顯著低于膿毒癥模型組(P＜0.05)，造模后6h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＞0.05);ROH組在造模后3h，6，h12h明顯低于膿毒癥模型組(P＜0.05)，在造模后9h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＞0.05);SLX組在造模后3h，6h，9h，12h與膿毒癥模型組差異不顯著(P＜0.05)。這一反常結果經(jīng)多次重復實驗確認，原因有待闡明。
　　2.2 膿毒癥時小鼠血清MMP-9

7、含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥小鼠血清MMP-9的含量在造模后3小時顯著上升(P＜0.05)，6小時達峰值，繼而回落，在造模后9h和12h與對照組無顯著差異(P＞0.05)。在造模后3h, HP組和ROH組與模型組相比顯著下降(P＜0.05)，SLX組無顯著性差異(P＞0.05);造模6h后，HP組、ROH組和SLX組與模型組相比顯著下降(P＜0.05)。這表明HP、ROH和SLX可以顯著抑制膿毒癥中MMP-9的表

8、達。
　　2.3 膿毒癥時小鼠血清HS含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥小鼠血清HS含量在造模后3h～12h的時間段內(nèi)與對照組相比顯著上升(P＜0.05)，說明糖萼損傷已經(jīng)發(fā)生。HP、ROH和SLX組在造模后3h～12h時間段內(nèi)小鼠血清HS含量與模型組相比，顯著下降(P＜0.05)，但仍舊高于正常組。HS是由HPA水解糖萼產(chǎn)生，雖然在造模后3h～12h，膿毒癥模型組小鼠血清HPA含量始終低于正常對照組，但從后續(xù)實

9、驗免疫組化的結果來看，膿毒癥模型組小鼠在心臟、小腸、腦組織水平表達比正常對照組明顯上升，說明組織中的HPA可以起到破壞糖萼的作用，因此在血清中可以檢測到糖萼脫落標志物HS的含量上升。
　　2.4 膿毒癥時小鼠血清Syndecan-1含量變化以及三種糖胺聚糖對此影響。
　　膿毒癥模型組小鼠血清Syndecan-1含量在造模3h～12h的時間段內(nèi)與對照組相比顯著上升(P＜0.05)，說明糖萼損傷已經(jīng)發(fā)生，具體表現(xiàn)為在造模后3～9

10、h持續(xù)上升，9h達峰值，繼而下降，12h仍高于正常對照組，(P＜0.05)。HP組在3h、6h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05);9h與模型組相比，顯著下降(P＜0.05)，12h無顯著性差異(P＞0.05)。ROH組在3h明顯高于模型組(P＜0.05)，6h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)，9h、12h與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05)。SLX組在3h、6h明顯高于模型組(P＜0.05)，在9h、12h與模型組相比

11、無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.三種糖胺聚糖對膿毒癥小鼠心臟組織的保護作用。
　　HE染色結果顯示，膿毒癥模型小鼠室壁局部心外膜下心肌細胞壞死、鈣化，HP、SLX、ROH干預后，上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠心臟主動脈內(nèi)皮細胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預后，心臟主動脈內(nèi)皮細胞糖萼損傷有不同程度的減輕。三者對膿毒癥小鼠心臟組織保護作用的強弱關系為:SLX＞HP＞ROH。免疫組化結果表明，膿毒癥小

12、鼠心臟組織中HPA，MMP-9的表達與對照組相比表達明顯增多，而HP、SLX、ROH對這兩種酶蛋白在心臟組織中的表達有抑制作用。
　　4.糖胺聚糖對膿毒癥小鼠小腸組織的保護作用。
　　HE染色結果顯示，膿毒癥模型組小鼠小腸大量腸絨毛脫落，粘膜固有層血管擴張、充血，局部大范圍腸粘膜全層壞死，HP、SLX、ROH干預之后，上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠小腸血管內(nèi)皮細胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預之后，小腸

13、血管內(nèi)皮細胞糖萼損傷有不同程度得減輕。三者對膿毒癥小鼠小腸組織保護作用的強弱關系為SLX＞ROH＞HP。免疫組化結果表明，膿毒癥小鼠小腸中HPA，MMP-9的表達與對照組相比表達明顯增多，而HP、SLX、ROH對兩種酶蛋白在小腸中的表達有抑制作用。
　　5.糖胺聚糖對膿毒癥小鼠大腦組織的保護作用。
　　HE染色結果顯示，膿毒癥模型組小鼠大腦皮層區(qū)域與對照組相比無明顯病理學改變，而海馬區(qū)神經(jīng)元腫脹，部分神經(jīng)元壞死。HP、SLX

14、、ROH干預后，海馬區(qū)上述病理改變減輕。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠大腦皮層內(nèi)皮細胞糖萼破壞明顯;HP、SLX、ROH干預之后，大腦皮層內(nèi)皮細胞糖萼損傷有不同程度的減輕。三者對膿毒癥小鼠大腦海馬區(qū)保護效果的強弱關系為:ROH≈SLX＞HP。免疫組化結果表明，膿毒癥小鼠大腦皮層和海馬區(qū)HPA，MMP-9的表達與對照組相比明顯增多，而HP、SLX、ROH對兩種酶蛋白在大腦組織中的表達有抑制作用。
　　綜上所述，本研究可以得出如下結論:H

15、P、SLX、ROH可以在膿毒癥時發(fā)揮糖萼保護作用，降低膿毒癥的死亡率。
　　本課題的創(chuàng)新之處在于:首先，盡管糖胺聚糖在膿毒癥的臨床治療中已經(jīng)積累了不少經(jīng)驗，但對糖萼的保護作用研究較少。本研究旨在闡明糖胺聚糖藥物治療膿毒癥的機制，拓寬糖胺聚糖藥物的應用范圍，為糖胺聚糖用于膿毒癥的臨床治療提供依據(jù)。其次，采用透射電鏡方法考察了膿毒癥小鼠心臟、小腸和大腦的內(nèi)皮糖萼微觀結構，透射電鏡觀察標本固定時未對小鼠做主動脈灌注，避免了糖萼在灌注過程

16、中的脫落。
　　本課題工作有待在以下幾個方面深入:(1)膿毒癥小鼠的血清HPA含量與正常組相比驟然下降，這一反常結果經(jīng)過多次重復實驗都是如此，對此需要進一步研究以闡明其原因。(2) ROH在膿毒癥小鼠28天生存率中表現(xiàn)出色，尤其是在造模后第二天生存率高達70％。但在后續(xù)對心臟、小腸和大腦保護作用的研究中，雖然ROH對內(nèi)皮糖萼保護作用明顯，卻并沒有始終保持最佳表現(xiàn)，這說明糖萼損傷雖是膿毒癥重要但非唯一的病理機制，ROH能夠顯著提高生