Hsp70在缺糖損傷的HeLa細胞中對Bax與Bcl-2表達及Bax構(gòu)象改變的影響.pdf

1、缺血性疾病常常對人體造成不可逆的損傷,其發(fā)生機制也日益受到人們的關(guān)注。葡萄糖的匱乏是缺血損傷的主要致病因素,由于葡萄糖的攝取是細胞內(nèi)能量代謝的中心環(huán)節(jié),所以缺糖損傷的直接嚴重后果就是細胞死亡,這一論點已經(jīng)得到了充分的證實。近年的研究還表明缺糖損傷還會導致細胞內(nèi)許多凋亡因子的產(chǎn)生,在眾多凋亡通道上左右著凋亡的進程。因此了解細胞在缺糖損傷過程中細胞水平,亞細胞水平及分子水平的變化對于缺糖損傷致病機制的闡明有重要的意義。
　　 人類宮

2、頸癌HeLa細胞是分子生物實驗常用的細胞模型。以往很多研究表明,熱激蛋白Hsp70在很多應(yīng)激情況下可以抑制細胞的凋亡,所以本文中主要檢測缺糖引起的HeLa細胞損傷情況以及Hsp70對其的影響。本文用獲贈的人類正義Hsp70重組質(zhì)粒[pcDNA3.1(+)-Hsp70]轉(zhuǎn)染正常HeLa細胞,用G418篩選并經(jīng)Western Blot法鑒定獲得了Hsp70過表達HeLa細胞。用無糖培養(yǎng)建立缺糖損傷細胞模型；用MTT法測細胞活率；用Hoech

3、st染色法和Giemsa染色法從形態(tài)上觀察并計算細胞凋亡率。結(jié)果表明,在缺糖48h內(nèi),Hsp70明顯抑制了缺糖誘導的HeLa細胞凋亡并增強其活力。
　　 以往研究證實,在細胞凋亡過程中,Hsp70主要通過與其它蛋白的相互作用來調(diào)控凋亡,包括Bcl-2家族。Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關(guān)鍵性作用的一類蛋白質(zhì),在細胞發(fā)生凋亡時,Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員能夠發(fā)生活化,移位到線粒體的外膜上,進而引起其他促凋亡因子的釋放

4、,導致細胞凋亡,但同時此現(xiàn)象能夠被該家族的抗凋亡蛋白阻止,所以Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的重要因素,尤其Bax/Bcl-2比值是啟動細胞凋亡的關(guān)鍵所在。
　　 為了進一步探討Hsp70抑制缺糖凋亡的機制,本文用RT-PCR法和Western-Blot法分別在mRNA和蛋白水平測Bax和Bel-2的表達,并計算Bax/Bcl-2比值；用細胞免疫化學法和熒光免疫法測Bax構(gòu)象改變情況。結(jié)果表明,HeLa細胞在缺糖48h內(nèi)

5、,Hsp70能夠抑制細胞中Bax/Bcl-2的增高以及Bax構(gòu)象的改變。根據(jù)以上結(jié)果我們初步推斷,在缺糖誘導的HeLa細胞中,Hsp70能夠通過與Bcl-2家族成員作用而抑制凋亡的發(fā)生。
　　 本研究采用Hsp70正常表達和過表達的兩組細胞,擬通過建立缺糖應(yīng)激損傷的模型,檢測并比較兩組模型在細胞水平及分子水平的損傷指標和相關(guān)凋亡因子的表達水平,來研究Hsp70對凋亡的影響及其可能機制。旨在為一些重要的應(yīng)激蛋白在能量代謝損傷過程中