Hsp70在缺糖損傷的HeLa細(xì)胞中對(duì)Bax與Bcl-2表達(dá)及Bax構(gòu)象改變的影響.pdf

1、缺血性疾病常常對(duì)人體造成不可逆的損傷,其發(fā)生機(jī)制也日益受到人們的關(guān)注。葡萄糖的匱乏是缺血損傷的主要致病因素,由于葡萄糖的攝取是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的中心環(huán)節(jié),所以缺糖損傷的直接嚴(yán)重后果就是細(xì)胞死亡,這一論點(diǎn)已經(jīng)得到了充分的證實(shí)。近年的研究還表明缺糖損傷還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)許多凋亡因子的產(chǎn)生,在眾多凋亡通道上左右著凋亡的進(jìn)程。因此了解細(xì)胞在缺糖損傷過(guò)程中細(xì)胞水平,亞細(xì)胞水平及分子水平的變化對(duì)于缺糖損傷致病機(jī)制的闡明有重要的意義。
　　 人類(lèi)宮

2、頸癌HeLa細(xì)胞是分子生物實(shí)驗(yàn)常用的細(xì)胞模型。以往很多研究表明,熱激蛋白Hsp70在很多應(yīng)激情況下可以抑制細(xì)胞的凋亡,所以本文中主要檢測(cè)缺糖引起的HeLa細(xì)胞損傷情況以及Hsp70對(duì)其的影響。本文用獲贈(zèng)的人類(lèi)正義Hsp70重組質(zhì)粒[pcDNA3.1(+)-Hsp70]轉(zhuǎn)染正常HeLa細(xì)胞,用G418篩選并經(jīng)Western Blot法鑒定獲得了Hsp70過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞。用無(wú)糖培養(yǎng)建立缺糖損傷細(xì)胞模型；用MTT法測(cè)細(xì)胞活率；用Hoech

3、st染色法和Giemsa染色法從形態(tài)上觀察并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,在缺糖48h內(nèi),Hsp70明顯抑制了缺糖誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其活力。
　　 以往研究證實(shí),在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,Hsp70主要通過(guò)與其它蛋白的相互作用來(lái)調(diào)控凋亡,包括Bcl-2家族。Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵性作用的一類(lèi)蛋白質(zhì),在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成員能夠發(fā)生活化,移位到線粒體的外膜上,進(jìn)而引起其他促凋亡因子的釋放

4、,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,但同時(shí)此現(xiàn)象能夠被該家族的抗凋亡蛋白阻止,所以Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的重要因素,尤其Bax/Bcl-2比值是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵所在。
　　 為了進(jìn)一步探討Hsp70抑制缺糖凋亡的機(jī)制,本文用RT-PCR法和Western-Blot法分別在mRNA和蛋白水平測(cè)Bax和Bel-2的表達(dá),并計(jì)算Bax/Bcl-2比值；用細(xì)胞免疫化學(xué)法和熒光免疫法測(cè)Bax構(gòu)象改變情況。結(jié)果表明,HeLa細(xì)胞在缺糖48h內(nèi)

5、,Hsp70能夠抑制細(xì)胞中Bax/Bcl-2的增高以及Bax構(gòu)象的改變。根據(jù)以上結(jié)果我們初步推斷,在缺糖誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中,Hsp70能夠通過(guò)與Bcl-2家族成員作用而抑制凋亡的發(fā)生。
　　 本研究采用Hsp70正常表達(dá)和過(guò)表達(dá)的兩組細(xì)胞,擬通過(guò)建立缺糖應(yīng)激損傷的模型,檢測(cè)并比較兩組模型在細(xì)胞水平及分子水平的損傷指標(biāo)和相關(guān)凋亡因子的表達(dá)水平,來(lái)研究Hsp70對(duì)凋亡的影響及其可能機(jī)制。旨在為一些重要的應(yīng)激蛋白在能量代謝損傷過(guò)程中