蒽與其受體介導(dǎo)的抗體相互作用及其酶聯(lián)免疫檢測研究.pdf

1、近年來多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)由于自身穩(wěn)定的化學(xué)特性而逐漸積累于環(huán)境中，各種礦物燃料或者其他高分子有機(jī)物的非完全燃燒和熱解反應(yīng)產(chǎn)物中均含有PAHs。PAHs有極強(qiáng)的“三致”作用，目前已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人體健康和生態(tài)環(huán)境，因而有必要對PAHs在環(huán)境介質(zhì)中的含量及遷移轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行研究和監(jiān)測，目前常用的檢測方法存在樣品前處理復(fù)雜，分析成本高，檢測周期長，儀器設(shè)備昂貴等不足之處。近年來

2、,酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)由于其操作簡便、特異性好、檢測限低而被廣泛用于環(huán)境樣品分析。
　　為建立多環(huán)芳烴的快速檢測方法，本文從暴露于污染物蒽的鯉肝臟中提取出芳香烴受體，采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行最大吸收波長掃描，并通過離子交換層析法分離純化了芳香烴受體，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定了受體的分子量，然后通過傅里葉變換紅外光譜分析探討了芳香烴受體與污染物配體

3、蒽結(jié)合后其蛋白結(jié)構(gòu)的變化。在此基礎(chǔ)上將配體與受體結(jié)合形成的復(fù)合物作為抗原，復(fù)合物的抗體作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG作為二抗，經(jīng)顯色反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀測定吸光度，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品中蒽的含量，同時(shí)優(yōu)化該方法各環(huán)節(jié)中的實(shí)驗(yàn)條件，并對試劑盒的特異性、重復(fù)性、保質(zhì)期及加標(biāo)回收率等進(jìn)行測試。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）紫外掃描圖譜顯示肝臟粗提取物在280nm處有蛋白特征吸收峰；通過蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=0.006

4、7x+0.0238，相關(guān)性系數(shù)R2=0.9958）計(jì)算得到受體蛋白濃度為27.3 mg/mL；利用離子交換層析法得到了單一組分的芳香烴受體蛋白；由聚丙烯酰胺凝膠電泳測得其分子量大約為110 kD。
　?。?）由傅里葉變換紅外光譜圖可知，受體與蒽結(jié)合后其蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，特定波段范圍內(nèi)的譜峰較結(jié)合蒽之前發(fā)生了明顯位移，其結(jié)合區(qū)域主要發(fā)生在酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶及指紋區(qū)，此外譜峰大多數(shù)是向低波數(shù)方向移動。
　　（3）通過i

5、c-ELISA法測得AHR抗體的效價(jià)為1:64000；ELISA分析方法的最適工作條件如下：包被抗原和一抗的最佳稀釋倍數(shù)分別為2000和8000；酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)為2000；最佳包被條件為抗原在4℃條件下包被12 h；最佳封閉液選擇為1％明膠，最佳封閉條件為37℃條件下封閉1.0h；抗原與一抗的最佳溫育時(shí)間為1.0h，溫度為37℃；一抗與二抗的最佳結(jié)合時(shí)間為1.0h，溫度為37℃；最佳顯色條件為不避光顯色15 min。
　　

6、（4）蒽的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=-0.11x+1.1713，R2=0.9826）在10 ng/mL~10μg/mL范圍內(nèi)均有良好的線性；其半抑制濃度IC50為185.95 ng/mL；最低檢測限約為2.43ng/mL。
　?。?）抗體與其它3種結(jié)構(gòu)類似抗原的交叉反應(yīng)率分別為5.7，19.1及＜0.1，其交叉反應(yīng)率均較小，表明抗體特異性強(qiáng)；OD值板內(nèi)及板間的變異系數(shù)分別為4.19%~9.23%和5.82%~9.51%，均小于10%；該試劑盒