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1、目的:1)建立靈敏且高度特異的LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中茶多酚(Tea polyphenols,TP)的4種兒茶素類(lèi)抗氧活性成分表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC),從而研究TP在大鼠體內(nèi)的多組分藥代動(dòng)力學(xué)。2)采用血清藥理學(xué)方法,研究TP的抗自由基藥效動(dòng)力學(xué)。3)分析TP的多效應(yīng)成分整合藥代動(dòng)力學(xué)與藥效動(dòng)力學(xué)(PK/PD)相關(guān)性。
方法:
2、血漿樣品經(jīng)乙酸乙酯液-液萃?。徊捎肊SI離子源,多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM),負(fù)離子掃描,測(cè)定EGCG、ECG、EGC和EC的血藥濃度;用于定量分析的檢測(cè)離子分別為m/z457.0→168.8(EGCG),m/z441.0→168.8(ECG),m/z305.1→124.8(EGC),m/z289.1→108.8(EC),m/z150.9→135.8(內(nèi)標(biāo),香草醛)。色譜柱為HypersilODSC18柱(2.1mm×150mm,5μm),
3、流動(dòng)相為甲醇-水(30:70),等度洗脫,流速:0.5mL·min-1:以香草醛為內(nèi)標(biāo),采用峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。大鼠單劑靜脈注射(iv)和口服(po)TP及單組分EGCG不同時(shí)間收集血漿樣品,測(cè)定血藥濃度;ⅳ所得C-T曲線由3p97程序擬合房室模型,計(jì)算有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù):po給藥后的C-T曲線按非房室模型方法求算有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù),評(píng)價(jià)po生物利用度。比較單組分給藥及多組分給藥時(shí)EGCG藥動(dòng)學(xué)的異同。制備膽瘺大鼠模型,以探討po TP后C-T曲
4、線雙峰現(xiàn)象是否與腸肝循環(huán)(EHC)有關(guān),并計(jì)算EHC分?jǐn)?shù)。應(yīng)用血清藥理學(xué)方法研究TP的抗自由基作用及其動(dòng)力學(xué);以Fenton反應(yīng)建立小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化體外模型,采用大鼠給藥后不同時(shí)間采集的含藥血清對(duì)體外小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率考察TP抗自由基效應(yīng),將效應(yīng)(E)對(duì)時(shí)間(T)作圖得E-T曲線,計(jì)算有關(guān)藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)各成分在4種成分總AUC中所占比值自定義各成分在整合濃度中各自的權(quán)重系數(shù),求算TP的整合濃度(Cint),繪制Cin
5、t-T曲線,進(jìn)一步進(jìn)行多效應(yīng)成分整合藥動(dòng)學(xué)的研究。以藥效(脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率)對(duì)logCint作圖,線性回歸,以相關(guān)系數(shù)r表示E-logCint的相關(guān)性,同時(shí)以E與各兒茶素類(lèi)成分的血藥濃度對(duì)數(shù)(log Cj)作圖,線性回歸所得相關(guān)系數(shù)r進(jìn)行比較。
結(jié)果:EGCG、ECG、EGC、EC和IS的保留時(shí)間分別為1.70、3.53、1.18、2.29和2.86min,各物質(zhì)之間達(dá)到基線分離。4種兒茶素類(lèi)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為
6、10~10000ng·mL-1(EGCG)和5~5000ng·mL-1(ECG、EGC和EC)(r>0.9966)。QC樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10%:準(zhǔn)確度均在90%~110%;EGCG、ECG、EGC、EC及IS的血漿樣品萃取回收率均大于72%,且基質(zhì)效應(yīng)在88%~106%。血漿樣品室溫保存至少8h內(nèi)穩(wěn)定,-20℃保存至少一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定,血漿樣品經(jīng)EtoAc萃取后2~4℃保存至少24h內(nèi)穩(wěn)定。靜脈注射(iv)TP50mg·k
7、g-1和100mg·kg-1后4種兒茶素類(lèi)主要活性成分的血漿藥代動(dòng)力學(xué)均符合三室模型,EGCG、ECG、EC和EGC的消除半衰期t1/2γ分別為651~705min、605~621min、144~159min和101~104min,4種組分的Vd分別為24~28L·kg-1、16~17L·kg-1、4.2~7.8L·kg-1和7.1~7.3L·kg-1,CL分別為0.026~0.029L·min-1·kg-1、0.018~0.019L·
8、min-1·kg-1、0027~0.038L·min-1·kg-1和0.041~0.046L·min-1·kg-1;口服TP50mg·kg-1和100mg·kg-1后上述4種組分按血管外給藥非房室模型分析,其C-T曲線呈雙峰或多峰現(xiàn)象,但膽瘺大鼠無(wú)此現(xiàn)象,提示TP口服C-T曲線的雙峰或多峰現(xiàn)象與EHC有關(guān),計(jì)算得EHC分?jǐn)?shù)為6.1%~21.8%。由AUC估算,EGCG、ECG、EC和EGC平均生物利用度(F)分別為3.29~9.93%、
9、3.27~8.85%、6.58~8.07%和9.24~14.3%。EGCG單組分iv給予TP50mg/kg,其t1/2為422min,Vd為25L·kg-1,CL為0.041min-1·kg-1,po生物利用度為1.34%。E-T曲線顯示ivTP后抗自由基作用的衰減分為三個(gè)先快后慢的不同時(shí)相,其t1/2α,E、t1/2β,E、t1/2γ,E和AUE分別為9.86min、80.08min、688.43min和42103。整合藥動(dòng)學(xué)與藥效動(dòng)
10、力學(xué)高度正相關(guān),其E-logCint作圖為一直線,線性回歸后得相關(guān)系數(shù)r2為0.9978(iv50mg·kg-1)和0.9962(iv100mg·kg-1),大于效應(yīng)與單組分ECG、EGC和EC血藥濃度對(duì)數(shù)作圖(E-logCj圖)所得相關(guān)系數(shù),而與主要活性成分ECG所得相關(guān)系數(shù)一致。
結(jié)論:本文建立的LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中TP主要活性成分EGCG、ECG、EGC和EC的濃度,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明特異性和靈敏度高、
11、精密度好、回收率高,且基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示,TP在大鼠體內(nèi)分布快速,自深室的消除較慢;分布廣泛,遠(yuǎn)大于總體水;4種兒茶素成分口服吸收迅速,但生物利用度較低,均<10%,4種兒茶素類(lèi)化合物中酯型兒茶素類(lèi)(EGCG和ECG)的動(dòng)力學(xué)與非酯型兒茶素類(lèi)(EGC和EC)的動(dòng)力學(xué)存在明顯差別,前者t1/2、Vd大于后者,但CL則小于后者。TP給藥的多組分藥動(dòng)學(xué)與EGCG單組分給藥的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行比較,前者t1/2長(zhǎng),po生物利用度高,說(shuō)
12、明TP中EGCG在多組分給藥時(shí)受到其他成分的影響,多組分給藥與單組分給藥有著不同的動(dòng)力學(xué)行為。以血清藥理學(xué)方法研究TP抗自由基藥效動(dòng)力學(xué),將其效應(yīng)指標(biāo)(脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率)和時(shí)間代入3p97程序進(jìn)行房室模型擬合,發(fā)現(xiàn)TP的藥效動(dòng)力學(xué)符合三室模型,其動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示,TP在本研究所用的劑量范圍內(nèi)藥效學(xué)呈線性。ivTP50mg·kg-1和100mg·kg-1后的整合藥代動(dòng)力學(xué)符合三室模型,并且與藥效動(dòng)力學(xué)行為相吻合。多效應(yīng)成分整合藥代動(dòng)力學(xué)較單
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