外泌體CXCR4橫向轉(zhuǎn)運促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和淋巴管生成能力.pdf

1、轉(zhuǎn)移是造成大多數(shù)惡性腫瘤患者死亡的主要原因。遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的先決條件，趨化因子受體及其配體之間的相互作用在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮十分重要的作用，靶器官特異性表達(dá)的趨化因子與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的相應(yīng)受體參與轉(zhuǎn)移器官的選擇。關(guān)于趨化因子受體CXCR4(CXC chemokmerecepter-4)及其配體SDF-1α（stromal cell-derived factor-1α）在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌

2、、胰腺癌和肝癌等多種腫瘤中被報道。
　　外泌體是最近發(fā)現(xiàn)的納米級(直徑30-150nm)雙層脂質(zhì)膜性小囊泡，內(nèi)含脂質(zhì)、核酸(DNA、mRNA、非編碼RNA)和蛋白質(zhì)等成分。外泌體可被受體細(xì)胞攝取，通過轉(zhuǎn)移其內(nèi)容物而影響受體細(xì)胞生物學(xué)行為。研究表明腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。
　　Hca-F和Hca-P是一對來源于同一親本細(xì)胞、具有不同淋巴道轉(zhuǎn)移能力的小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株，

3、接種于615小鼠足墊后Hca-F細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移力高于70％，而Hca-P細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率則低于30％，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。此前的研究表明，Hca-F和Hca-P細(xì)胞表面表達(dá)的CXCR4可與615小鼠淋巴結(jié)勻漿中的SDF-1α結(jié)合，誘導(dǎo)Hca-F和Hca-P細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2），從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而且Hca-F細(xì)胞表達(dá)的CXCR4水平明顯高于Hca-P細(xì)胞，產(chǎn)生的MM

4、P-9和MMP-2也更多。但外泌體源性CXCR4在小鼠肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用和機(jī)制尚未見報道。
　　目的:
　　(1)探討高轉(zhuǎn)移力Hca-F細(xì)胞來源外泌體促進(jìn)低轉(zhuǎn)移力Hca-P細(xì)胞遷移和侵襲能力與趨化因子受體CXCR4的關(guān)系;(2)探討Hca-F細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管形成能力與CXCR4的關(guān)系。
　　方法:
　　(1)無外泌體血清培養(yǎng)Hca-F和Hca-P細(xì)胞，通過超速離心（100000

5、g/分鐘）提取外泌體（分別標(biāo)記為F-Exo和P-Exo），應(yīng)用透射電子顯微觀察細(xì)胞外囊泡的直徑和形態(tài)，Western blot檢測外泌體特有膜表面分子CD63和HSP70蛋白表達(dá)，驗證提取外泌體的可靠性。
　　(2)利用熒光染料PKH26將F-Exo染成紅色，與受體細(xì)胞Hca-P（事先用DAPI染核呈藍(lán)色）共孵育，激光共聚焦顯微鏡下觀察受體細(xì)胞中帶有紅色熒光的外泌體攝取情況。
　　(3)利用脂質(zhì)體Lipofectamine2

6、000轉(zhuǎn)染CXCR4的小干擾RNA(siRNA)(siCXCR4組)，以siRNA無關(guān)序列(NC組)和Hca-F細(xì)胞本身（Control組）作為陰性對照。
　　結(jié)果:
　　(1)透射電子顯微鏡下可見所提取的囊泡呈球狀，直徑約30-100nm，含雙層膜，符合外泌體的形態(tài)特征;Western blot結(jié)果顯示外泌體的標(biāo)記物CD63、HSP70在提取的囊泡中表達(dá)明顯，β-tubulin則在細(xì)胞中表達(dá)明顯，表明外泌體提取成功。

7、>　　(2)激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞核被藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記的Hca-P細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有紅色熒光染料PKH26標(biāo)記的外泌體，表明F-Exo可被Hca-P細(xì)胞攝取。
　　(3)Transwell小室遷移實驗（無基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示與Hca-F細(xì)胞外泌體共孵育的Hca-P細(xì)胞（Hca-P+F-Exo組）穿膜細(xì)胞數(shù)（400±2.6）顯著多于Hca-P細(xì)胞本身（228±9.3），差別顯著(P＜0.05);Transwell小室侵襲實

8、驗（基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示Hca-P+F-Exo組穿膜細(xì)胞數(shù)（229±3.8）顯著多于Hca-P組（98±5.1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示F-Exo中CXCR4蛋白水平明顯高于P-Exo，并且與F-Exo孵育的Hca-P細(xì)胞（Hca-P+F-Exo組）中CXCR4蛋白表達(dá)也顯著高于Hca-P細(xì)胞本身，但仍略少于Hca-F細(xì)胞。
　　(4)Western blot結(jié)果顯示siCXCR4組C

9、XCR4蛋白水平均顯著低于Control組和NC組(P＜0.05)，表明siRNA轉(zhuǎn)染成功。提取上述三組細(xì)胞分泌的外泌體，Western blot檢測顯示siCXCR4組外泌體（siCXCR4-Exo組）中CXCR4蛋白水平也顯著低于陰性對照（Control-Exo組和NC-Exo組）。Hca-P細(xì)胞與CXCR4敲低Hca-F細(xì)胞外泌體孵育（Hca-P+siCXCR4-Exo組）后，CXCR4蛋白表達(dá)顯著低于陰性對照（Hca-P+NC-

10、Exo組）。Transwell小室遷移實驗（無基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示Hca-P+siCXCR4-Exo組穿膜細(xì)胞數(shù)（365±3.5）顯著低于Hca-P+NC-Exo組（503±5.3），差別顯著(P＜0.05)。Transwell小室侵襲實驗（基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示Hca-P+siCXCR4-Exo組穿膜細(xì)胞數(shù)（147±4.2）顯著低于-Hca-P+NC-Exo組（389±5.7），差別顯著（P＜0.01）。
　　Transwell小

11、室（含0.4μm孔徑薄膜）的上室Hca-F細(xì)胞使用外泌體抑制劑GW4869處理，收集下室的Hca-P細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示Hca-P+F-GW4869組CXCR4的表達(dá)量顯著低于陰性對照DMSO處理(Hca-P+F-DMSO)組;下室Hca-P細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至具有8.0μm孔徑的Tanswell小室，Transwell小室遷移實驗（無基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示Hca-P+F-GW4869組穿膜細(xì)胞數(shù)（196±2.5）顯著低于Hca

12、-P+F-DMSO組（524±4.3），差別顯著(P＜0.01);Transwell小室侵襲實驗（基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示Hca-P+F-GW4869組穿膜細(xì)胞數(shù)（173±2.2）顯著低于Hca-P+F-DMSO組（375±5.4），差別具有顯著性(P＜0.01)。
　　(5)Transwell小室遷移實驗（無基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示CXCR4敲低Hca-F細(xì)胞與SDF-1α孵育后（siCXCR4+SDF-1α組）穿膜細(xì)胞數(shù)（92±3.3

13、）顯著低于陰性對照Control+SDF-1α組（286±2.1）和NC+SDF-1α組（319±4.1），P值均小于0.05，而與Hca-F細(xì)胞本身（Hca-F組，119±4.5）相當(dāng)。Transwell小室侵襲實驗（基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示siCXCR4+SDF-1α組穿膜細(xì)胞數(shù)（52±2.3）也顯著低于Control+SDF-1α組（201±5.1）和NC+SDF-1α組（157±4.9），P值均小于0.05，而與Hca-F組（69±

14、2.5）相當(dāng)。Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照Control+SDF-1α組和NC+SDF-1α組相比，siCXCR4+SDF-1α組MMP-9、MMP-2、VEGF-C蛋白表達(dá)顯著降低，而與Hca-F組相當(dāng)。
　　用淋巴內(nèi)皮細(xì)胞代替SDF-1α后，Transwell小室遷移實驗（無基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示siCXCR4+LEC組穿膜細(xì)胞數(shù)（103±2.3）顯著低于Control+LEC組（307±4.1）和NC+LEC組

15、（319±5.1），P值均小于0.05，而與Hca-F組（132±4.4）無顯著差別。Transwell小室侵襲實驗（基質(zhì)膠包被）結(jié)果顯示siCXCR4+LEC組穿膜細(xì)胞數(shù)（52±2.3）顯著低于Control+LEC組（216±5.1）和NC+LEC組（219±4.6），P值均小于0.05，而與Hca-F組（89±2.7）相當(dāng)。Western blot結(jié)果顯示MMP-9、MMP-2、VEGF-C蛋白表達(dá)在siCXCR4+LEC組明顯低

16、于Control+LEC組和NC+LEC組，與Hca-F組相當(dāng)。
　　(6)淋巴管形成實驗結(jié)果顯示與CXCR4敲低Hca-F細(xì)胞來源外泌體孵育后，LEC形成的管腔數(shù)量顯著低于陰性對照Control-Exo+LEC組和NC-Exo+LEC組(P＜0.01)。CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示與CXCR4敲低Hca-F細(xì)胞來源外泌體孵育后，LEC增殖速度低于Control-Exo+LEC組和NC-Exo+LEC組(P＜0.05)。

17、　　來自Hca-F細(xì)胞的外泌體與CXCR4沉默的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)(LEC-siCXCR4+F-Exo)組，淋巴管形成數(shù)量與陰性對照組相比無明顯差異(P＞0.05);CCK-8實驗顯示LEC-siCXCR4+F-Exo組與陰性對照組以相似的速率增長。
　　結(jié)論:
　　(1)Hca-P細(xì)胞可攝入Hca-F細(xì)胞分泌的外泌體從而增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。
　　(2)Hca-F細(xì)胞分泌的外泌體可通過轉(zhuǎn)運CXCR4增強(qiáng)Hca-P細(xì)