Caveolin-1-VEGF信號(hào)通路及Sema3A對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD-R損傷的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：研究Caveolin-1/VEGF信號(hào)通路及Sema3A對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷的調(diào)節(jié)作用，探討缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能受損的機(jī)制。
　　方法：購(gòu)買(mǎi)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株，傳代培養(yǎng)，通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，適時(shí)凍存或傳代。細(xì)胞分組:隨機(jī)分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪/復(fù)氧模型組（Oxygen glucose deprivation and reoxygenation，OGD/R）、小凹蛋白-1(Caveolin-1

2、，Cav-1)基因沉默組、Cav-1基因沉默OGD/R組。對(duì)正常對(duì)照組的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng);對(duì)OGD/R組，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期缺氧缺糖6h復(fù)氧24h建立OGD/R模型;對(duì)Cav-1基因沉默組，利用慢病毒載體包裝的Cav-1 RNAi干擾細(xì)胞中的Cav-1建立Cav-1基因沉默模型;對(duì)Cav-1基因沉默OGD/R組，在Cav-1基因沉默的基礎(chǔ)上再建立OGD/R模型。指標(biāo)檢測(cè):CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)Ca

3、v-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表達(dá)，免疫印跡(Western blot，Wb)法和免疫熒光法檢測(cè)Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴細(xì)胞株傳代順利，以1×106的細(xì)胞密度鋪板，培養(yǎng)5h即貼壁生長(zhǎng)，24h時(shí)呈現(xiàn)典型“鋪路石”樣形態(tài)，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段，說(shuō)明大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功。⑵OGD/R組細(xì)胞存活率低于正常對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明成功建立大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模

4、型。⑶基因沉默組的Cav-1mRNA表達(dá)、Cav-1蛋白表達(dá)均低于正常對(duì)照組，差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05、P＜0.01)，說(shuō)明成功建立Cav-1基因沉默模型。⑷Cav-1、VEGF、Sema3A的mRNA的表達(dá)：Cav-1mRNA表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)上升，Cav-1基因沉默組表達(dá)下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

5、.05）；VEGF mRNA表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組、Cav-1基因沉默組以及Cav-1基因沉默OGD/R組的VEGF mRNA表達(dá)均下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); OGD/R組與Cav-1基因沉默OGD/R組比較，VEGFmRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；Sema3A mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組

6、比較，OGD/R組表達(dá)上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。⑸Cav-1、VEGF、Sema3A的蛋白表達(dá)。Wb法結(jié)果：Cav-1表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)上升，Cav-1基因沉默組表達(dá)下降，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01);與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默O

7、CD/R組表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGF表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)下降，Cav-1基因沉默組表達(dá)下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Sema3A表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組和Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。免疫熒光法結(jié)果：Cav-1表達(dá)分別與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01);Cav-1基因沉默組

8、表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。與OGD/R組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Cav-1基因沉默組比較，Cav-1基因沉默OGD/R組表達(dá)上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；VEGF表達(dá)與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Sema3A表達(dá)與正常對(duì)照組比較，OGD/R組表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。6.Cav-1與