早期分泌型抗原靶6(ESAT6)抑制小鼠巨噬細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、目的:早期分泌型抗原靶6能夠通過激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制自噬的作用，從而促進(jìn)卡介苗的生長增殖，研究ESAT6對(duì)溶酶體與自噬小體的融合之間的相互作用關(guān)系，為EAST6介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.對(duì)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間pCMV-HA-ESAT6質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞裂解，BCA法測蛋白濃度，蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測細(xì)胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。然后對(duì)轉(zhuǎn)染pCMV-HA-E

2、SAT6重組質(zhì)粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA對(duì)照質(zhì)粒和CQ與pCMV-HA-ESAT6轉(zhuǎn)染聯(lián)合處理?xiàng)l件下的RFP-GFP-LC3-RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，熒光顯微鏡下記錄結(jié)果，并用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)數(shù);進(jìn)行細(xì)胞裂解，用BCA法測蛋白濃度，蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。
　　2.對(duì)EBSS（Earle平衡鹽溶液）以及轉(zhuǎn)染pCMV-HA-ESAT6重組質(zhì)粒、pCMV-HA對(duì)照質(zhì)粒處理的RAW2

3、64.7細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解，然后接種于羅琴培養(yǎng)基上，觀察BCG的生長情況。然后對(duì)轉(zhuǎn)染pCMV-HA-ESAT6重組質(zhì)粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA對(duì)照質(zhì)粒和CQ與pCMV-HA-ESAT6轉(zhuǎn)染聯(lián)合處理?xiàng)l件下的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞裂解，接種于羅琴培養(yǎng)基上，觀察BCG的生長情況。
　　3.對(duì)轉(zhuǎn)染pCMV-HA-ESAT6的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，進(jìn)行細(xì)胞裂解，測蛋白濃度，用Western Blot的方法檢測

4、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p-mTOR、p-70S6K、p62的蛋白水平。然后用mTOR的抑制劑Torin1和ESAT6共同處理RAW264.7，用LysoTracker Red染色溶酶體，并用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)數(shù)溶酶體的數(shù)量;用蛋白免疫印記法檢測p-70S6K、p62、p-mTOR的量;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解后進(jìn)行BCG的培養(yǎng)。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染ESAT6質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞隨著時(shí)間的延長，LC3Ⅱ的水平逐漸增加，對(duì)用ESAT6

5、和CQ處理的三組RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，其LC3Ⅱ的量相差不多，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都高于對(duì)照組，熒光顯微鏡結(jié)果顯示，ESAT6和CQ處理組自噬體數(shù)目差不多，但都高于對(duì)照組;
　　2.經(jīng)EBSS處理的BCG的生長較對(duì)照組減少，經(jīng)ESAT6處理的BCG的生長較對(duì)照組增加;經(jīng)CQ以及ESAT6處理的BCG生長都較對(duì)照組增加，且三組生長水平差不多。
　　3.經(jīng)轉(zhuǎn)染ESAT6的RAW264.7細(xì)胞，免疫印記結(jié)果顯示，LC3Ⅱ、

6、p-mTOR、p-70S6K、p62的水平都較對(duì)照組增加;經(jīng)ESAT6和Torin1處理的RAW264.7細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示p62和p-mTOR的量比ESAT6單獨(dú)處理時(shí)減少，LysoTracker Red染料法結(jié)果顯示在Torin1單獨(dú)存在或與ESAT6共同存在時(shí)，恢復(fù)了ESAT6單獨(dú)處理時(shí)所致的染色減少;BCG結(jié)果顯示在Torin1單獨(dú)存在或與ESAT6共同存在時(shí)，BCG的生長情況都較ESAT6單獨(dú)處理時(shí)減少。