CFTR低表達在HHcy致ApoE---鼠動脈粥樣硬化脂代謝紊亂中的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗擬觀察肝臟組織囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）表達改變及其介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（en-doplasmic reticulum stress，ERS）在高同型半胱氨酸血癥（hyperhomo cysteinemia，HHcy）致ApoE－/－鼠動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)脂代謝紊亂中的作

2、用及其機制，探討HHcy致AS的可能作用靶點。
　　方法：
　　選用SPF級近交系C57BL/6J背景的5周齡雄性ApoE－/－小鼠為研究對象，適應環(huán)境一周后，將小鼠隨機分為4組：正常對照組（n＝6）：選擇健康5周齡雄鼠（SPF級C57BL/6J），飼以正常飲食。另選5周齡雄性純合子 ApoE－/－鼠（SPF級近交系C57BL/6J）18只，隨機分為3組，每組6只：ApoE－/－對照組、高蛋氨酸組、干預組，分別給予正常飲食、

3、高蛋氨酸飲食、高蛋氨酸飲食加0.006%葉酸及0.0004%維生素B12。喂養(yǎng)14周后眼球取血，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清同型半胱氨酸水平；主動脈病理切片進行HE染色、肝臟冰凍切片進行油紅O染色；全自動生化分析儀檢測血清LDL、HDL、TG、CHOL含量；DAPI染色觀察肝組織細胞核；透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)；實時定量熒光 PCR檢測小鼠肝組織CFTR、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78

4、，GRP78）、活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、X盒結(jié)合蛋白-1（X-box binding protein-1，XBP-1）mRNA的表達以及免疫組織化學法檢測小鼠腎臟CFTR蛋白的表達；酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked i

5、mmunosorbent assay，ELISA）檢測肝組織中caspase-12、Grp78、ATF6、PERK、XBP-1的含量；
　　結(jié)果高蛋氨酸組小鼠血清Hcy水平顯著增加（P<0.01），干預組血清Hcy水平較高蛋氨酸組降低（P<0.05）；主動脈HE染色結(jié)果顯示與正常對照組比較，高蛋氨酸組小鼠主動脈管壁可見大量動脈粥樣硬化樣物質(zhì)，干預組小鼠主動脈管壁病變較高蛋氨酸組有所緩解。由此表示，小鼠HHcy和動脈粥樣硬化雙模型建

6、立成功。
　　全自動生化儀結(jié)果顯示高蛋氨酸組血清LDL、TG、CHOL含量顯著增加(P<0.01)、血清HDL含量顯著降低（P<0.01），干預組血清LDL、TG、CHOL含量較高蛋氨酸組降低（P<0.05）、血清HDL含量較高蛋氨酸組增加（P<0.05）；肝臟油紅O染色結(jié)果顯示與正常對照組比較，高蛋氨酸組小鼠肝臟可見大量脂滴存在，干預組小鼠肝臟脂滴較高蛋氨酸組減少。
　　4000倍鏡下線粒體腫脹或濃縮、嵴斷裂或變短、粗面內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均大量增生，干預組線粒體略有腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有增生。實時定量熒光 PCR結(jié)果顯示，高蛋氨酸組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表達組顯著增加（P<0.01），干預組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA的表達較高蛋氨酸組顯著降低（P<0.01）；ELISA結(jié)果表明高蛋氨酸組Grp78、PERK、ATF6、XBP-1含量顯著增加（P<0.01），干預組血清Grp78、PERK

8、、ATF6、XBP-1含量較高蛋氨酸組降低（P<0.05）。
　　DAPI染色結(jié)果顯示高蛋氨酸組可見細胞核增大，細胞核膜與周圍邊界不清晰，干預組細胞核則大小較均一，核膜光滑。透射電鏡結(jié)果顯示700倍鏡下高蛋氨酸組染色質(zhì)聚集濃縮或邊緣化，可見凋亡小體及前體，干預組細胞膜完整，染色質(zhì)略微聚集凝固未見凋亡小體及前體。ELISA結(jié)果顯示高蛋氨酸組caspase-12的含量顯著增加（P<0.05）干預組caspase-12的含量含量較高蛋氨

9、酸組降低。
　　實時定量熒光PCR結(jié)果顯示，高蛋氨酸組CFTR mRNA的表達顯著降低（P<0.01），干預組CFTR mRNA的表達較高蛋氨酸組顯著增加（P<0.01）；小鼠肝組織經(jīng)免疫組化染色后通過Image Pro Plu6.0軟件統(tǒng)計CFTR蛋白陽性染色區(qū)域，免疫組織化學法檢測CFTR蛋白的表達與其mRNA的表達變化一致；
　　小鼠肝臟CFTR mRNA表達與GRP78、ATF6、PERK、XBP-1 mRNA表達的