變形鏈球菌UA159comD缺陷菌株的構(gòu)建及毒力研究.pdf

1、變形鏈球菌(Streptococcus mutans,S.m)被公認(rèn)為重要的致齲菌,其主要的毒力因子包括產(chǎn)酸耐酸性,黏附素、葡聚糖的產(chǎn)生,其發(fā)揮致齲作用的重要前提條件是形成菌斑生物膜結(jié)構(gòu)。
　　 密度感應(yīng)是細(xì)菌之間進(jìn)行信號傳遞的一種特殊機(jī)制,其本質(zhì)是細(xì)菌對外界的信號進(jìn)行識別并轉(zhuǎn)變?yōu)榛蚣せ罨蚱渌?xì)胞反應(yīng)。密度感應(yīng)信號系統(tǒng)在變形鏈球菌生物膜形成、感受態(tài)形成、毒力因子表達(dá)等方面起著重要的作用。變形鏈球菌是革蘭陽性菌,擁有Lux-S及

2、AI-2介導(dǎo)的密度感應(yīng)系統(tǒng),控制不同種屬間的信號交流;及一個(gè)肽信號介導(dǎo)的雙組份密度感應(yīng)系統(tǒng),對細(xì)菌種屬內(nèi)信號交流進(jìn)行調(diào)控。
　　 變形鏈球菌com感受態(tài)基因家族屬于雙組分信號系統(tǒng),comD基因編碼的是一個(gè)二聚體化跨膜感受器,它能感受特異性的刺激,將外界信號傳遞到胞內(nèi)。已有研究證明comD基因與細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)化、對酸的耐受性和感應(yīng)性、細(xì)菌素的產(chǎn)生及生物膜的形成有關(guān),但目前關(guān)于該基因與變形鏈球菌致主要齲毒力因子的相關(guān)性研究尚未深入。<

3、br>　　 目的：本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建S.mUA159 comD基因缺陷菌株,進(jìn)一步探討comD基因?qū).muA159致齲毒力的影響,從基因水平探討S.m密度感應(yīng)信號系統(tǒng)與其致齲毒力的相關(guān)性,為研究密度感應(yīng)信號系統(tǒng)調(diào)控在齲病防治中的意義提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用長臂同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(LFH-PCR)制備中間為紅霉素耐藥基因(erm,兩側(cè)為comD基因上、下游同源序列的連接片段,并將此片段轉(zhuǎn)化入S

4、.mUA159標(biāo)準(zhǔn)菌株,在含紅霉素的BHI瓊脂平板上篩選出轉(zhuǎn)化菌株,并對轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生化特性檢測、PCR、RT-PCR及測序鑒定。
　　 2.比較S.mUA159comD缺陷菌與標(biāo)準(zhǔn)菌致齲相關(guān)毒力的差異。
　　 2.1 掃描電鏡觀察分析S.mUA159 comD缺陷菌與標(biāo)準(zhǔn)菌在人牙釉質(zhì)表面形成的菌斑生物膜結(jié)構(gòu):在含2％蔗糖的BHI培養(yǎng)條件下,掃描電鏡觀察比較6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上comD缺陷菌與標(biāo)準(zhǔn)

5、菌生物膜的形成情況。
　　 2.2 應(yīng)用熒光定量PCR(FQ-PCR)法定量檢測S.mUA159 comD缺陷菌與標(biāo)準(zhǔn)菌中多糖代謝相關(guān)基因(gtfa、gtfD、gtfC、ftf)mRNA的表達(dá)水平。
　　 2.3 檢測S.mUA159 comD缺陷菌與標(biāo)準(zhǔn)菌中與產(chǎn)酸相關(guān)的乳酸脫氫酶(LDH)酶活性水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察及生化檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株為變形鏈球菌,RT-PCR、PCR及序列測序結(jié)

6、果顯示comD基因完全被erm基因所替代,表明S.m UA159 comD缺陷菌株構(gòu)建成功。
　　 2.對comD缺陷菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)形成的生物膜的結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),兩個(gè)菌株在6h、12h、24h時(shí)均有明顯的生物膜形成,comD缺陷菌株形成的生物膜孔隙較大、結(jié)構(gòu)較疏松。
　　 3.FQ-PCR分析結(jié)果顯示:在comD缺陷菌株中4個(gè)與多糖代謝相關(guān)的基因(gtfB、gtfC、gtfD、ftf)mRNA表達(dá)水平均下調(diào),與

7、標(biāo)準(zhǔn)菌株相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 4.對S.m標(biāo)準(zhǔn)菌與缺陷菌LDH的測定結(jié)果顯示:在缺陷菌株中,LDH酶活性水平降低,與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.用LFH-PCR技術(shù)制備基因突變體,可完全替代靶基因,是S.m功能基因組研究的一種有效的方法。
　　 2.S.m UA159 comD基因缺陷后,與多糖代謝酶相關(guān)的gtfB、gtfD、gt