喹諾酮類藥物廣譜免疫分析研究.pdf

1、喹諾酮類藥物是一類廣譜抗菌的藥物，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，但其在動(dòng)物源性食品中的殘留嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康。因此十分有必要加強(qiáng)對(duì)喹諾酮類的監(jiān)測(cè)。目前針對(duì)喹諾酮類的監(jiān)測(cè)方法主要是高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等儀器方法。雖然靈敏度和準(zhǔn)確性較高，但其用時(shí)長(zhǎng)，成本高，前處理步驟繁瑣，難以滿足快速大批量的檢測(cè)要求。而基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫分析方法具有操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏和成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量的快速篩選，喹諾酮廣譜免疫分析方法可同

2、時(shí)檢測(cè)兩種及以上的藥物，具有巨大的優(yōu)勢(shì)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中的作用越來越重要，而實(shí)現(xiàn)廣譜免疫分析關(guān)鍵在于獲得廣譜特異性抗體。本論文選取3種喹諾酮類藥物為研究對(duì)象，結(jié)合結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行廣譜性半抗原/抗原的設(shè)計(jì)合成、多克隆抗體的制備及多種免疫分析方法研究，并探討了喹諾酮類抗體的廣譜識(shí)別機(jī)制。
　　（1）吡哌酸為半抗原的廣譜免疫分析研究
　　吡哌酸具有喹諾酮母核結(jié)構(gòu)特征，且在C-7位為廣譜性藥物特征結(jié)構(gòu)-哌嗪環(huán)。因此選用吡哌酸為半抗原

3、，制備吡哌酸抗體進(jìn)行廣譜性研究?；诋愒床呗越⑦吝咚崦庖叻治龇椒?，半抑制濃度（IC50）為6.0 ng/mL，靈敏度明顯增強(qiáng)。交叉反應(yīng)結(jié)果顯示，有18種喹諾酮類交叉反應(yīng)率低于9.2％。表明吡哌酸抗體特異性較強(qiáng)。結(jié)合3D QSAR分析吡哌酸與廣譜性藥物諾氟沙星結(jié)構(gòu)差異，不同于諾氟沙星C-7位哌嗪環(huán)平分于母環(huán)兩側(cè)，吡哌酸在C-7位的哌嗪環(huán)與母環(huán)在同一平面，呈“一”字型，形成抗體空腔較扁平，無法容納導(dǎo)致較大的基團(tuán)，是吡哌酸抗體廣譜性能不佳的

4、主要原因。此外，在N-1位帶大基團(tuán)或負(fù)電荷的原子影響抗體的結(jié)合親和力。同時(shí)，應(yīng)用所建立的方法研究雞蛋中吡哌酸動(dòng)態(tài)殘留規(guī)律，結(jié)果顯示吡哌酸在第5天達(dá)到峰值，第14天降低至100 ng/g以下。說明所建立的ELISA檢測(cè)方法可用于食品中吡哌酸藥物殘留的檢測(cè)和監(jiān)控，并為吡哌酸在雞蛋中的殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　?。?）克林沙星為半抗原的廣譜免疫分析研究
　　克林沙星與廣譜性藥物環(huán)丙沙星和恩諾沙星結(jié)構(gòu)相似，僅在C-7位和C

5、-8位上基團(tuán)不同。與上一章吡哌酸相比，它在C-8位帶有氯原子基團(tuán)，可與N-1位基團(tuán)相互作用形成類似環(huán)的結(jié)構(gòu)。基于此，選用克林沙星為半抗原制備抗體進(jìn)行廣譜免疫分析研究。在同源模式下，從不同位點(diǎn)合成兩種克林沙星示蹤物。優(yōu)化選擇最優(yōu)組合建立FPIA方法，IC50為25.6 ng/mL，靈敏度較高。特異性結(jié)果顯示19種喹諾酮交叉反應(yīng)率均低于5%，克林沙星抗體特異性較強(qiáng)。3D QSAR研究發(fā)現(xiàn)克林沙星在C-7位的五元環(huán)和氨基形成的空腔較小，且偏向

6、一邊，無法容納像哌嗪環(huán)一樣的大基團(tuán)，是克林沙星抗體廣譜性較差的主要原因。此外C-8位和N-1位非環(huán)狀結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致克林沙星無法識(shí)別在此位點(diǎn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的喹諾酮類藥物。應(yīng)用FPIA方法檢測(cè)牛奶中克林沙星，添加回收率為97.9%~112.7%，批內(nèi)變異系數(shù)均低于7.1%，高效液相色譜法（HPLC）驗(yàn)證顯示兩者具有良好的一致性。說明本方法適用于牛奶樣品中克林沙星的監(jiān)測(cè)和分析。
　　基于異源競(jìng)爭(zhēng)模式建立羊奶中克林沙星FPIA方法。設(shè)計(jì)合成克林沙

7、星同源示蹤物和五種異源示蹤物，比較并篩選出異源示蹤物PAZ-FITC與克林沙星抗體組合最優(yōu)，F(xiàn)PIA法結(jié)果顯示IC50為29.3 ng/mL，靈敏度明顯提高，為同源組合的6倍。在羊奶中平均添加回收率為96.6%，平均變異系數(shù)為5.3%，可滿足快速檢測(cè)的需求。說明基于異源策略的FPIA方法是一種快速、高通量的檢測(cè)方法，可用于羊奶樣品中克林沙星的監(jiān)測(cè)和分析。此外，發(fā)現(xiàn)帕珠沙星作為異源示蹤物可提高抗體親和力和特異性，因此，在之后選用帕珠沙星作

8、為半抗原進(jìn)行抗體制備和性能研究。
　?。?）帕珠沙星為半抗原的廣譜免疫分析研究
　　不同于大部分喹諾酮類藥物帶有哌嗪環(huán)，帕珠沙星在C-7位的基團(tuán)為氨基環(huán)丙基，且在C-8位和N-1位為氧氮雜環(huán)，可能可提高廣譜性。本研究選用帕珠沙星制備多克隆抗體。優(yōu)化條件選擇最優(yōu)組合建立高靈敏的ELISA方法，結(jié)果顯示所建立的ELISA方法IC50為10.3 ng/mL，靈敏度較高。特異性分析結(jié)果顯示帕珠沙星抗體可識(shí)別24種喹諾酮類藥物，具有廣

9、譜性。應(yīng)用3D QSAR分析發(fā)現(xiàn)立體場(chǎng)對(duì)抗體識(shí)別起主要作用，在C-7位的氨基和環(huán)丙基形成的V形結(jié)構(gòu)可形成較大空腔，是帕珠沙星抗體具有廣譜識(shí)別性能的主要因素，在C-8位和N-1位為氧氮雜環(huán)，有利于識(shí)別在相同位置為環(huán)狀或類似環(huán)狀結(jié)構(gòu)的喹諾酮類，在N-1位上帶大基團(tuán)不利于抗體的結(jié)合親和力。
　　綜上所述，本研究選用吡哌酸、克林沙星和帕珠沙星3種喹諾酮藥物為對(duì)象，偶聯(lián)制備多克隆抗體進(jìn)行廣譜性免疫分析研究，應(yīng)用3D QSAR分析發(fā)現(xiàn)立體場(chǎng)對(duì)