克雷伯屬和變形桿菌屬16S-23SrRNA基因間區(qū)分析及奶粉中重要要致病菌檢測基因芯片的研制.pdf

1、本文對克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的重要菌種的16S-23S rRNA基因間區(qū)(16S-23S rRNA internal transcribed spacer,簡稱ITS)進行了測序和分析,為利用ITS基因簇中的變異區(qū)進行菌種鑒定奠定了基礎(chǔ)。本文還研制了奶粉中重要致病菌檢測基因芯片,基于ITS和O抗原基因設(shè)計和篩選了探針,正是ITS序列破譯和分析工作的延伸。
　　 克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的某些種是重要的人類致病菌,能引起多種疾病

2、,危害嚴重。與此同時,多重耐藥菌株的出現(xiàn)近年來持續(xù)增加,因此急需積累這些菌的相關(guān)資料,為預(yù)防和控制這些病原菌提供技術(shù)支持。然而,克雷伯屬和變形桿菌屬的屬內(nèi)不同種間差別不大,現(xiàn)有的鑒定手段不易區(qū)分。近年來,ITS因具有更高的分辨率,對于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分比16S rRNA和23SrRNA更具優(yōu)勢。然而ITS數(shù)據(jù)資源少,滿足不了序列分析特異性的需要。因此我們破譯并分析了克雷伯氏菌屬和變形桿菌屬的間區(qū),探討其可否應(yīng)用于菌種的檢測和鑒定。

3、
　　 本研究完成了21株克雷伯屬菌株的ITS序列破譯,最終得到了336條ITS序列?？死撞暇鷮俚姆窝卓死撞暇?、臭鼻克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌、解鳥氨酸克雷伯氏菌均含有三種間區(qū)類型:ITSnone,ITSglu和ITSile+ala;而鼻硬結(jié)克雷伯氏菌只含有兩種間區(qū)類型:ITSglu和ITSile+ala。這是目前所知的,在腸桿菌科中只有克雷伯屬有ITSnone類型的間區(qū)?？死撞畬買TS序列種

4、內(nèi)是高度保守的,ITSnone間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.961-1.000,ITSglu間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.967-1.000,ITSile+ala間區(qū)的種內(nèi)序列相似性是0.968-1.000。克雷伯屬種間序列相似性比16s rDNA序列相似性要低,ITSnone是0.775-0.989,ITSglu是0.798-0.997,ITSile+ala是0.712-0.985。在ITSnone序列中,有2個變異區(qū);在ITSglu中有5個

5、變異區(qū);在ITSile+ala中有6個變異區(qū)。這些變異區(qū)主要位于tRNA基因和23S rRNA基因之間和兩個tRNA基因之間。進化分析表明,基于ITS構(gòu)建的進化樹與基于16S rRNA基因構(gòu)建的進化樹很相似。此外,我們還基于ITS設(shè)計并篩選得到了特異性擴增和檢測肺炎克雷伯氏菌和臭鼻克雷伯氏菌。
　　 同樣的,我們破譯了46株變形桿菌的831條ITS序列,分析表明變形桿菌屬有兩種ITS類型:ITSglu和ITSile+ala。根據(jù)

6、ITS類型和長度,可將變行桿菌ITS序列分為28個變體,根據(jù)堿基序列相似性,這28個變體是25個不同的基因起源。ITS序列種內(nèi)高度保守,序列相似性高達96.2-100％。所有ITS序列可劃分為三個保守區(qū)和兩個變異區(qū),保守區(qū)和變異區(qū)鑲嵌排列,構(gòu)成了“馬賽克”狀I(lǐng)TS序列結(jié)構(gòu)?；谧冃螚U菌ITS的第二個變異區(qū)(v2)構(gòu)建的進化樹比16SrDNA序列構(gòu)建的進化樹可將潘氏變形桿菌同普通變形桿菌分的更開。在ITSglu的變異區(qū)設(shè)計的特異引物,可特

7、異的將奇異變形桿菌與其他臨床上常見的普通變形桿菌、潘氏變形桿菌、產(chǎn)粘變形桿菌等區(qū)分開。
　　 本文分析了克雷伯屬和變形桿菌屬的ITS序列,確定了保守區(qū)和變異區(qū),為基于ITS對菌種進行檢測和鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　 基因芯片是一種可以對核酸分子進行平行和高通量檢測的技術(shù),本文以奶粉中常見的坂崎腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、鮑曼不動桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌和大

8、腸桿菌O157計10種致病菌為檢測對象研制了病原菌檢測用基因芯片。利用ITS序列和大腸桿菌O157的O抗原基因簇中的特異基因wzy設(shè)計引物和探針對這些菌種進行檢測和鑒定。樣品經(jīng)過兩步法前處理后,用裂解液提取基因組,用作PCR模板DNA,然后只加入下游引物進行擴增和標記,標記產(chǎn)物與芯片雜交?？傆嬘?85株菌(134個檢測范圍內(nèi)的菌株和51個其他種菌株)進行了芯片性能評價,篩選得到了27條特異檢測。完成了芯片的特異性、靈敏度、多樣品檢測和雙