鯉魚肝胰臟cDNA文庫(kù)構(gòu)建、EST分析及脂肪酸結(jié)合蛋白樣基因的初步研究.pdf

1、本文通過構(gòu)建鯉魚(Cyprinus carpio)肝胰臟cDNA文庫(kù)、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag，EST)分析以及對(duì)脂肪酸結(jié)合蛋白樣基因的初步研究，旨在深入了解鯉魚脂類代謝的相關(guān)功能及機(jī)制。cDNA質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建采用了Gateway<'TM>技術(shù)，經(jīng)檢測(cè)，文庫(kù)的平均滴度(Titer)為1.193×10<'6> cfu/ml，文庫(kù)總菌落形成單位(CFUs)為1.432×10<'7> cfu。隨機(jī)挑選1074個(gè)

2、cDNA文庫(kù)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行5'單向測(cè)序，共獲得了1016條有效的ESTs，平均長(zhǎng)度約為792bp。運(yùn)用生物信息分析軟件DNAStar進(jìn)行質(zhì)檢和拼接組裝為基因重疊群(Contig)，共獲得397條有效的一致序列(Consensuses)序列。其中115個(gè)contigs包含2條以上的EST序列，其余282個(gè)僅含有一條EST(Singleton)。基于GenBank非冗余公共數(shù)據(jù)庫(kù)等的EST分析系統(tǒng)結(jié)果顯示，397條consensuses中共

3、有215條(54.15﹪)與GenBank非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)的已知功能蛋白基因具有較高同源性。122條(30.73﹪)序列類似于功能未知的ESTs和cosmid序列；60條(15.11﹪)在GenBank中找不到任何相似的序列。與已知功能蛋白編碼序列有較高的同源性的215條consensuses(共包含721條ESTs)，依據(jù)功能分為3大類，181條consensuses蛋白編碼序列(包括540條ESTs)屬于結(jié)構(gòu)蛋白和酶類等看家基因歸屬為A

4、類；25條consensuses蛋白編碼序列(包括156條ESTs)屬于B類，執(zhí)行細(xì)胞與細(xì)胞通訊的功能；C類9條consensuses蛋白編碼序列(包括25條ESTs)屬于轉(zhuǎn)錄因子和其他調(diào)節(jié)蛋白。通過EST聚類拼接得到兩條具有完整開放閱讀框的肝基本型脂肪酸結(jié)合蛋白樣(Liver basic fatty acid binding protein—like，Lb-FABP—like)cDNA序列，fabp10a-like、fabp10b-l

5、ike cDNA序列分別長(zhǎng)507bp、517bp，開放閱讀框都為381bp，編碼126個(gè)氨基酸，無(wú)信號(hào)肽。氨基酸序列同源性分析表明，鯉魚FABP10-like A和FABP10-like B與斑馬魚(Danio rerio)FABP10同源相似性最高，與哺乳動(dòng)物肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)同源性較低。進(jìn)化樹分析表明，鯉魚FABP10-likeA和FABP10-like B與斑馬魚、兩棲類、爬行類、鳥類的Lb—FABP在同一進(jìn)化支上

6、，區(qū)別于另一類肝型L-FABP。成體組織分布結(jié)果顯示，鯉魚fabp10-like mRNA在肝胰臟、中腸、后腸表達(dá)豐富，其它組織除脂肪和前腸外都有微量表達(dá)。胚胎及幼體發(fā)育各期表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，fabp10-like mRNA最早在胚體形成期開始有表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸上升。出膜后的仔魚FABP10-like都有明顯表達(dá)。fabp10-like mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果提示：隨著鯉魚胚胎發(fā)育逐步形成肝胰臟及腸后，F(xiàn)ABP10-like可能在肝胰