血漿microRNA作為肝癌及慢性乙肝肝損傷分子標(biāo)記物的研究.pdf

1、世界范圍內(nèi)，乙肝病毒(HBV)感染人群超過(guò)了4億。其中1/3的感染發(fā)生在中國(guó)。持續(xù)的HBV可造成肝功能失調(diào)，肝硬化甚至肝癌。在我國(guó)，由于乙肝病毒感染率居高不下導(dǎo)致肝癌的發(fā)病率非常高，“乙肝-肝硬化-肝癌”被稱(chēng)為肝癌三部曲。
　　 肝細(xì)胞肝癌(HCC，以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多發(fā)于東南亞及非洲，病毒性肝炎及黃曲霉毒素是目前己明確的致癌高危因子。在我國(guó)，肝癌是第二位腫瘤殺手，全世界每年的新發(fā)病例55％來(lái)自中國(guó)。現(xiàn)

2、代醫(yī)學(xué)對(duì)肝癌進(jìn)行科學(xué)研究一百多年，雖然取得了不少成績(jī)，但肝癌人群的總體5年生存率至今仍只有7％左右。在我國(guó)，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入肝癌晚期，從而失去治療機(jī)會(huì)。及時(shí)準(zhǔn)確的診斷是降低死亡率的有效途徑。甲胎蛋白(AFP)是目前最常用的肝癌標(biāo)記物，但是在生殖細(xì)胞腫瘤，胃腸道腫瘤及肝硬化患者中也能觀察到AFP升高。另外，僅有70％的肝癌患者AFP升高。30％的患者缺乏有效的診斷分子標(biāo)記物。因此尋找新的肝癌診斷生物標(biāo)記物成為目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。

3、
　　 乙肝感染導(dǎo)致的慢性肝損傷是肝硬化和肝癌的罪魁禍?zhǔn)住Ｓ行У乇O(jiān)測(cè)慢性乙肝(CHB)患者肝損傷的程度并及時(shí)的干預(yù)對(duì)于治療肝臟纖維化、肝硬化以及肝癌至關(guān)重要。目前肝穿刺活檢是評(píng)估CHB肝損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。肝穿刺病理形態(tài)學(xué)檢查可以直觀地評(píng)估肝臟炎癥、肝細(xì)胞損傷和纖維化程度。然而，有創(chuàng)的穿刺活檢可能導(dǎo)致大出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，患者常常難以接受。另外，穿刺的部位選擇可能影響檢查的結(jié)果。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)是目前臨床上常用的肝臟損傷血清學(xué)指標(biāo)，

4、由于其與肝損傷的組織學(xué)形態(tài)改變相關(guān)性不好，其特異性和敏感性常常受到質(zhì)疑。因此，尋找可以反應(yīng)組織學(xué)形態(tài)的變化，并且靈敏度和特異性比ALT更好的指標(biāo)，也是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 近十多年以來(lái)microRNA的研究成為分子生物學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)。microRNA是一類(lèi)進(jìn)化保守的內(nèi)源性表達(dá)的小RNA，為20-25個(gè)核苷酸(nt)，它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開(kāi)放閱讀框。成熟的microRNA，5’

5、端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3’端為羥基。microRNA可以調(diào)控靶mRNA的表達(dá)。在1993年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就被認(rèn)為在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。microRNA的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性，在癌癥領(lǐng)域的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，microRNA在不同的癌癥組織中具有相對(duì)特異性的表達(dá)譜，提示microRNA可能會(huì)成為診斷疾病的新的分子標(biāo)記物。同時(shí)，由于microRNA的特殊結(jié)構(gòu)，可以抵御RNA酶的降解，在血漿或血清中的microRNA能夠穩(wěn)定地存在。

6、因此研究認(rèn)為，外周血microRNA有可能成為理想的新型疾病分子標(biāo)記物。高通量的microRNA檢測(cè)技術(shù)如microRNA芯片、基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法為全基因組范圍的microRNA譜分析提供了有力的技術(shù)支持。
　　 本課題利用高通量microRNA芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了血漿microRNA在肝癌患者的特異性表達(dá)譜。通過(guò)qRT-PCR的驗(yàn)證，找到關(guān)鍵的microRNA。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析和獨(dú)立樣本中

7、的驗(yàn)證，建立了診斷HCC的診斷模型，以期可以幫助HCC的診斷，提高診斷準(zhǔn)確性，降低漏診率，使得HCC患者可以早發(fā)現(xiàn)早治療，提高五年生存率。同時(shí)，在研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在CHB肝損傷患者中表達(dá)異常的microRNA。利用相同的檢測(cè)方法，在第二部分研究中，增加了CHB血漿樣本量并收集了CHB肝穿刺標(biāo)本，進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)microRNA與肝組織損傷的相關(guān)性。以期為慢性肝損傷的研究提供新思路。
　　 第一部分血漿microRNA作為乙肝相關(guān)性

8、肝癌早期診斷標(biāo)記物的研究
　　 目的：通過(guò)microRNA芯片篩選和qRT-PCR驗(yàn)證肝癌血漿microRNA，并研究其作為血漿標(biāo)記物，診斷肝癌的準(zhǔn)確性。
　　 方法：首先用microRNA芯片篩選肝癌患者和三組對(duì)照樣本(健康組、慢性乙肝患者、肝硬化患者)血漿microRNA的表達(dá)譜。通過(guò)Gene Spring軟件和聚類(lèi)分析篩選肝癌差異表達(dá)的血漿microRNA。芯片篩選出的肝癌差異microRNA進(jìn)一步用qRT-PCR

9、在407例訓(xùn)練集檢測(cè)其表達(dá)?；谟?xùn)練集的檢測(cè)結(jié)果，構(gòu)建了肝癌診斷的Logistic回歸模型，ROC分析被用來(lái)評(píng)估其診斷效能。驗(yàn)證集被用來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該模型。
　　 結(jié)果：發(fā)現(xiàn)了一組血漿microRNA(miR-122，miR-192，miR-21，miR-223，miR-26a，miR-27a and miR-801)。構(gòu)建了這些血漿microRNA表達(dá)值組成的回歸模型，可以準(zhǔn)確地區(qū)分肝癌樣本和對(duì)照樣本(訓(xùn)練集AUC=0.864，

10、驗(yàn)證集AUC=0.888)。該模型的診斷準(zhǔn)確性不會(huì)受到肝癌分期的影響(BCLC0期，A期，B期，C期的AUC分別為0.888，0.888，0.901，0.881)。該模型也能將肝癌患者從健康人(AUC=0.941)、慢性乙肝患者(AUC=0.842)、乙肝肝硬化患者(AUC=0.884)中區(qū)分開(kāi)來(lái)。
　　 結(jié)論：該血漿microRNA模型可以用于幫助診斷肝癌患者，對(duì)從而使一大批以前因?yàn)槿狈υ\斷而失去根治性治療的患者得到及時(shí)的治療

11、。
　　 第二部分慢性乙肝患者血漿microRNA與肝臟組織病理形態(tài)學(xué)相關(guān)性的研究
　　 目的：尋找慢性乙肝肝損傷患者表達(dá)差異的血漿microRNA并進(jìn)一步研究其與組織病理學(xué)的相關(guān)性及作為監(jiān)測(cè)肝損傷分子標(biāo)記的可行性。
　　 方法：首先我們用芯片檢測(cè)22例CHB患者和33例健康人血漿microRNA的表達(dá)譜。通過(guò)Gene Spring軟件和聚類(lèi)分析篩選在CHB患者血漿中表達(dá)升高的microRNA。進(jìn)一步用qRT-P

12、CR在118例CHB患者和58例健康人中驗(yàn)證其表達(dá)值。驗(yàn)證后的血漿差異表達(dá)microRNA在66例患者對(duì)應(yīng)的肝穿刺組織檢測(cè)其表達(dá)，用來(lái)評(píng)估血漿microRNA和組織microRNA表達(dá)的相關(guān)性。并分析其作為診斷CHB肝損傷的標(biāo)記物的可行性。
　　 結(jié)果：miR-122，miR-148a，miR-192，miR-194，miR-215，miR-27b在血漿中的表達(dá)隨著炎癥活動(dòng)程度和纖維化程度的增加，均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，并且在組織中的

13、表達(dá)有相似的變化。與無(wú)肝細(xì)胞壞死的組相比，有肝細(xì)胞壞死組中6個(gè)microRNA的表達(dá)明顯下降，同樣與無(wú)纖維化組比較，在有纖維化組下降顯著(p<0.01)。建立由miR-122，miR-148a，miR-194，miR-27b組成的診斷模型，區(qū)分CHB病人與正常人對(duì)照，AUC=0.938；由miR-148a和miR-194組成的診斷模型，診斷CHB病人中有無(wú)肝細(xì)胞壞死，AUC=0.857，miR-122診斷CHB病人中有無(wú)肝纖維化，AUC