P38信號通路在氧化性低密度脂蛋白導致內皮祖細胞數量及功能改變方面的作用.pdf

1、內皮祖細胞（EPC）是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內皮細胞，但尚未表達成熟血管內皮細胞表型特征的前體細胞。研究發(fā)現，EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程。干細胞因子（SCF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF），HMG-coA還原酶抑制劑、粒系巨噬系集落刺激因子（GM-CSF）等都能自骨髓動員EPC，并促進其增殖、分化、粘附和遷移能力.氧化性低密度脂蛋白是冠心病獨立危險因素，其生物學作用主要是影響內

2、皮細胞功能，并進一步導致動脈粥樣硬化。研究證明EPC對維持內皮結構和功能的完整性具有重要作用，并且參與了機體多種生理、病理性血管重建過程，在新形成的血管中，EPC來源的內皮細胞約占總內皮細胞的25％。EPC促進血管生成和內皮再生是因為EPC能夠從骨髓動員到外周循環(huán)中，并歸巢到血管損傷和生成的部位。EPC歸巢需要多步驟協調作用，包括趨化、粘附、跨內皮遷移及最終分化為內皮細胞。最近，臨床試驗表明冠狀動脈疾病患者培養(yǎng)的EPC數量及遷移能力明顯

3、下降。氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）為心血管疾病的重要獨立危險因素，而且冠狀動脈疾病及糖尿病患者血漿oxLDL生成明顯增加。以前的研究表明oxLDL能夠誘導內皮細胞凋亡、增加內皮細胞粘附分子的表達、抑制內皮細胞遷移而抑制血管新生?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測。oxLDL可能為影響EPC數量和功能的因素。本研究的目的是觀察oxLDL是否影響外周血EPC的數量；是否改變了EPC的增殖功能、遷移功能及粘附能力；oxLDL對EPC的體外血管生成

4、能力的影響程度；同時觀察oxLDL是否影響EPC的P38信號表達，來影響EPC的數量、功能。本研究分為二個部分，主要研究方法和結果如下： 第一章氧化型低密度脂蛋白對內皮祖細胞存活和功能的影響 目的：研究氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）對EPC存活及功能的影響方法： 1.EPC的分離、培養(yǎng)：取健康成人空腹外周靜脈血，用密度梯度離心法獲取單個核細胞，培養(yǎng)7天，收集貼壁細胞。貼壁細胞隨機分成5組：①對照組；②oxLDL

5、各濃度組（共3組）：在培養(yǎng)液中分別加入25，50，100，200μg/ml后培養(yǎng)24小時；③LDL組：含100μg/ml的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。 2.細胞染色與鑒定：分離獲得的單個核細胞培養(yǎng)7d后形成了梭形的內皮樣細胞。 4.EPC粘附能力檢測：收集貼壁細胞，懸浮在500μl培養(yǎng)液并計數，然后將等量EPC接種到包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)30min，計數貼壁細胞。 5.EPC遷移能力檢測：收集貼壁細胞

6、并計數。將600μl培養(yǎng)液和VEGF（50ng/mL）加入改良的Boyden室的下室，將2×104EPC懸浮在100μl培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動細胞，計數遷移到低層的細胞。 6.EPC增殖能力檢測：采用promega公司的Non-Radioactive Cell Proliferation Assay試劑盒MTS/PMS比色法檢測細胞增殖率，按操作程序執(zhí)行。 結果： 1.EPC的鑒定：分離

7、獲得的單個核細胞培養(yǎng)3天即可看到貼壁生長，7天后形成梭形的內皮樣細胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-Ⅰ對細胞染色后，通過熒光顯微鏡鑒定UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPC占貼壁細胞的90％。流式細胞儀檢測貼壁細胞表面標志。 2.oxLDL對外周血EPC數量的影響：不同濃度的OxLDL干預EPC后24小時，結果顯示：oxLDL顯著減少EPC數量，并且EPC數量隨著oxLDL的濃度的增加而減少。而L

8、DL對EPC數量無影響。 4.OxLDL對外周血EPC遷移功能的影響：OxLDL各濃度組明顯減少EPC的遷移能力，而LDL對EPC的遷移無影響。 5.OxLDL對外周血EPC增殖功能的影響：EPC的增殖能力在OxLDL各濃度組抑制了EPC的增殖，并且隨著其濃度的增加而加劇。 結論： 1.OxLDL在體外能減少EPC數量，作用呈濃度依賴性； 2.OxLDL在體外能抑制EPC的增殖、遷移、粘附能力，作

9、用呈濃度和依賴性； 3.OxLDL能降低EPC的體外血管生成能力；提示OxLDL是導致EPC數量及功能減弱的因素之一。 第二章P38信號通路參與oxLDL對內皮祖細胞數量和功能的影響 目的：研究oxLDL是否導致EPC細胞內P38及P-P38的表達異常，以及oxLDL對EPC的作用是否與細胞內P38的信號有關。 方法： 1.EPC分離，培養(yǎng)，及分組：EPC的分離及培養(yǎng)見第一章，收集貼壁細胞。貼壁細

10、胞隨機三組：①對照組；②oxLDL組：在培養(yǎng)液中加入100μg/ml的oxLDL③SB203580組：在培養(yǎng)液中加入100μg/ml的oxLDL前，預先半小時加入0.5μM的SB203580。 2.Western檢測p38及p-p38的表達：oxLDL（100μg/ml）處理EPC后0，5，15，25，35分鐘及SB203580預處理后細胞內p38，及p-p38蛋白的表達；以及oxLDL25，50，100，200μg/ml以及L

11、DL100μg/ml處理30分鐘后細胞內p38，及p-p38蛋白的表達。 3.EPC凋亡分析： 按BDBiosciences公司的說明進行操作：各組EPC處理結束后，用0.1％胰酶消化，40℃PBS洗兩次后，重懸于結合緩沖液中，調整細胞濃度為1×106/ml。取100μl細胞懸液至5ml試管中，加5μlAnnexinⅤ-FITC標記液和5μlPI，輕輕混勻。并設立無AnnexinⅤ及PI的空白對照、僅AnnexinⅤ的對

12、照、僅PI的對照。室溫避光孵育15min后，加400μl結合緩沖液，1小時內上流式細胞儀檢測EPC雙染色鑒定EPC數量，EPC粘附能力檢測，遷移能力檢測，EPC增殖能力檢測，體外血管生成能力檢測實驗方法見第一章。 結果： 1.western檢測結果：100μg/ml的oxLDL處理EPC后，細胞內p-p38成時間依賴性表達增強，大約25min時達頂峰，5，15，25，25，35分鐘細胞內p-p38的表達是對照組的1.4±

13、0.15倍，2.1±0.22倍，3.2±0.34倍，1.5±0.13倍，且p38拮抗劑sb203580可抑制其表達，是對照組的1.2±0.13倍，與各時間點比較有顯著性差異，P<0.05。不同濃度的OxLDL處理25min后觀察，細胞內p-p38成劑量依賴性表達增強，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml處理EPC后，其細胞內p-p38的表達是分別對照組的1.2±0.13，1.7±0.18，3.2±0.35，

14、3.4±0.35。而LDL對其沒影響。細胞內p38表達不受時間和濃度的影響。 2.100μg/ml的oxLDL處理EPC后，導致EPC數量減少，增殖減低，凋亡增加，粘附及遷移能力減低，體外成血管能力減弱。而sb203580能減弱100μg/ml的oxLDL對EPC的作用。 結論： oxLDL對EPC的作用與細胞內磷酸化的p38表達及活性有關。P38的抑制劑sb203580能抑制oxLDL對EPC的毒性作用。提示o