CHEK2與REV3L基因多態(tài)的肺癌易感性關(guān)聯(lián)與機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：
　　肺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果。肺癌的發(fā)生與環(huán)境暴露引起DNA損傷后的修復(fù)能力密切相關(guān),而細(xì)胞周期檢控點(diǎn)是維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的一個(gè)重要機(jī)制,其中DNA損傷檢控點(diǎn)能檢測(cè)細(xì)胞在生命活動(dòng)過(guò)程中出現(xiàn)的DNA損傷并引發(fā)細(xì)胞周期阻滯,為修復(fù)損傷提供足夠的時(shí)間。CHEK2基因在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮了重要作用;當(dāng)DNA出現(xiàn)損傷時(shí),ATM與ATR激活CHEK2蛋白,后者將這一信號(hào)傳遞給能磷酸化E2F-1、BRCA

2、1和P53等多個(gè)蛋白,啟動(dòng)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn)CHEK2基因突變與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生具有密切的關(guān)系。
　　我們推測(cè)CHEK2基因啟動(dòng)子上的遺傳變異可能會(huì)影響CHEK2基因最終的表達(dá)量,影響個(gè)體肺癌易感性的差異,為了檢驗(yàn)這一假設(shè),我們采用了病例一對(duì)照的研究方法,選擇了該基因近端啟動(dòng)子上-122C＞G與-48G＞A兩個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)位點(diǎn),利用Illumina分型方法對(duì)500例中國(guó)漢族肺癌患者和5

3、17例年齡、性別與之相匹配的正常對(duì)照進(jìn)行了基因分型,研究了不同等位基因型和基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性;然后在另外575例肺癌患者和589例對(duì)照人群中驗(yàn)證該多態(tài)和肺癌易感性的相關(guān)性。我們還進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶、凝膠遷移率電泳、染色質(zhì)免疫共沉淀等方法深入的探索了陽(yáng)性位點(diǎn)的功能。
　　在單位點(diǎn)分析中,我們發(fā)現(xiàn)CHEK2的啟動(dòng)子多態(tài)-48G＞A(rs2236141)位點(diǎn)的等位基因型分布在病例和對(duì)照中存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P值為0.0018。非

4、條件logistic回歸分析表明,rs2236141位點(diǎn)的突變雜合基因型可以顯著降低患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)(與GG基因型相比,GA基因型的校正OR=0.65,95％CI=0.40-0.85)。而rs2236142多態(tài)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著相關(guān)性。在驗(yàn)證性關(guān)聯(lián)分析中,我們發(fā)現(xiàn)rs2236141多態(tài)的基因型分布在病例和對(duì)照中也存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)。兩次關(guān)聯(lián)分析結(jié)果合并后,rs2236141多態(tài)的基因型分布在病例和對(duì)照中存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差

5、異(P=0.001);rs2236141位點(diǎn)的突變雜合基因型可以顯著降低患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)1.4倍(P=4×10-4)。
　　功能研究表明,在正常人外周血和肺組織中,A等位基因型的個(gè)體CHEK2mRNA水平高于G等位基因型個(gè)體。由于G→A轉(zhuǎn)換可能減少一個(gè)甲基化位點(diǎn)(CG→CA),因而該多態(tài)可能影響表觀遺傳學(xué)調(diào)控。熒光素酶試驗(yàn)表明,G/A等位型啟動(dòng)子表達(dá)沒(méi)有顯著差異:但在甲基化條件下,等位型A等位型啟動(dòng)子對(duì)于顯著高于A等位型。凝膠遷移率電

6、泳實(shí)驗(yàn)和表面等離子共振實(shí)驗(yàn)表明甲基化的G等位型啟動(dòng)子能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。采用體內(nèi)染色質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)表明,結(jié)合在該多態(tài)附近的轉(zhuǎn)錄因子為Sp1,且該轉(zhuǎn)錄因子起負(fù)調(diào)控作用。
　　本研究表明CHEK2基因啟動(dòng)子rs2236141多態(tài)與中國(guó)人群中肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有顯著相關(guān)性;該多態(tài)位點(diǎn)為功能位點(diǎn),突變型等位基因與負(fù)調(diào)控的Sp1蛋白結(jié)合力較弱,因而表達(dá)更高,具有保護(hù)作用。
　　第二部分：
　　跨損傷DNA合成(Translesio

7、n DNA Synthesis,TLS),屬于一種復(fù)制后修復(fù)過(guò)程,主要包括DNA聚合酶κ、η、ι、ζ等?？鐡p傷DNA合成途徑是生物體的一種應(yīng)急機(jī)制,能夠在DNA損傷未被修復(fù)的狀態(tài)下進(jìn)行復(fù)制延伸。REV3L(hREV3)是DNA聚合酶的ζ的催化亞基,是跨損傷DNA合成途徑的主要參與者。近年來(lái)研究表明REV3L基因能維持基因組穩(wěn)定性,但也不可避免的會(huì)引起DNA突變。因而REV3L基因的多態(tài)有可能影響REV3L基因最終的表達(dá)量,從而影響肺癌的

8、易感性。
　　為了檢驗(yàn)這一假設(shè),我們采用了病例一對(duì)照的研究方法,選擇了該基因上的15個(gè)多態(tài)位點(diǎn),對(duì)南京地區(qū)500例肺癌患者和517例正常對(duì)照進(jìn)行了基因分型,研究不同等位基因型和基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性;然后在來(lái)自上海地區(qū)的575例肺癌患者和589例對(duì)照人群中驗(yàn)證該多態(tài)和肺癌易感性的相關(guān)性。我們還進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶、表面等離子共振、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法深入的探索了陽(yáng)性位點(diǎn)的功能。
　　在單位點(diǎn)分析中,我們發(fā)現(xiàn)R

9、EV3L基因上rs465646、rs459809和rs1002481三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布在病例和對(duì)照中存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中3’UTR460T＞C(rs465646)多態(tài)位于3’UTR的一段保守區(qū)域中,其余兩個(gè)SNP位于功能尚不清楚的內(nèi)含子中。Rs465646多態(tài)的C等位型攜帶者顯著降低肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.015)。我們?cè)隍?yàn)證性關(guān)聯(lián)分析中,我們發(fā)現(xiàn)rs465646多態(tài)的基因型分布在病例和對(duì)照中也存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.0

10、49)。
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明,REV3L基因3’UTR上有多個(gè)microRNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn);T＞C多態(tài)會(huì)影響多個(gè)miRNA的結(jié)合。我們用表面等離子共振的方法,發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點(diǎn)附近與miR-25和miR-32均有結(jié)合。熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明,共轉(zhuǎn)染miR-25和miR-32均能顯著降低含有REV3L基因3'UTR的報(bào)告基因的表達(dá),表明上述miRNA能負(fù)調(diào)控REV3L基因的表達(dá);此外,等離子表面共振實(shí)驗(yàn)表明,T等位型RNA與上述

11、兩種miRNA的結(jié)合能力更強(qiáng)。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示C等位型表達(dá)顯著高于T等位型。煙草提取物能誘導(dǎo)REV3L基因表達(dá),同時(shí)伴隨著miR-32表達(dá)的顯著降低,而miR-25表達(dá)沒(méi)有顯著變化;這表明miR-32可能在REV3L的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起主要作用。REV3L基因的過(guò)表達(dá)能降低細(xì)胞的克隆形成,減少微核率,這表明REV3L基因具有穩(wěn)定基因組、抑制腫瘤增殖的作用。我們轉(zhuǎn)染兩種等位型RNA來(lái)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源miRNA,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染T等位型RNA后細(xì)胞克隆